Komplex fehérjeanalitikai módszerek alkalmazása. a Proteomika Szolgáltató Laboratóriumban - a. teljes proteomikai munkafolyamat kivitelezése

Átírás

1 Komplex fehérjeanalitikai módszerek alkalmazása a Proteomika Szolgáltató Laboratóriumban - a teljes proteomikai munkafolyamat kivitelezése Dr. Csősz Éva Proteomika Szolgáltató Laboratórium Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet

2 Műszerpark MALDI-TOF PSZL LC-MS/MS ESI-QTRAP Kétdimenziós elektroforézis Bio-Plex

3 Munkatársak Prof. Dr. Tőzsér József Dr. Csősz Éva Kulcsár Andrea Hallgatók Lábiscsák Péter II. Mol. Biol. MSc Emri Zsófia II. Vegyész BSc Kallós Gergő I. Mol. Biol. MSc

5 Voyager DE PRO (ABSciex) MALDI-TOF tömegspektrométer

6 Tömegspektrométerek felépítése Minta bemenet Elektronika Ion forrás Tömeg analizátor Detektor Adatfeldolgozó rendszer Vákuum rendszer Tömeg spektrum

7 MALDI Mátrix által segített lézer deszorpció ionizáció (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) Mintatartó lemez Lézer Minta MH Analizátor Detektor Mátrix kv mintát mátrixal együtt kristályosítják a minta ionizációját a mátrix ionok segítik egyszeres vagy kétszeres töltésű ionok keletkeznek

8 MALDI Mátrix által segített lézer deszorpció ionizáció (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) Mintatartó lemez hn 1. Minta (M) a feleslegben lévő mátrixxal (X)összekeverve és szárítva a mintatartólemezen. Minta és mátrix keveréke Grid

9 MALDI Mátrix által segített lézer deszorpció ionizáció (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) hn Lézer 2. Lézer hatására semleges mátrix (X) és minta molekulák(m), valamint mátrix ionok keletkeznek (XH) +, (X- H) Minta molekulákat ionizálják a mátrix ionok: XH + + M X + MH +. X-H - + M X + M-H -

10 MALDI Mátrix által segített lézer deszorpció ionizáció (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) hn 4. Ion Extrakció: Nagy feszültség hatására az ionok MH + felgyorsulnak és kirepülnek a forrásból az analizátor felé. +20 kv

11 Az ionok útja a repülési idő (Time-Of-Flight) TOF analizátorban A TOF analizátorban az ionok a kinetikus energiájuk és nagyságuk alapján vándorolnak A kisebb ionok gyorsabban, a nagyobb ionok lassabban mozognak az analizátorban Minél hosszabb az ionok útja, annál szebb elválást eredményez Ionforrás Analizátor Detektor

12 % Intensity Felhasználási területek, mintaigény Pontos móltömeg-meghatározás 100 Voyager Spec #1[B P = , 24125] E+4 fehérje azonosítás fehérje tisztulásának ellenőrzése ACTH (1-17) (1 pmól) ACTH (7-39) (1,5 pmól) fehérje intaktságának vizsgálata fehérje módosítások kimutatása ACTH (18-39) (0,75 pmól) Insulin (bovine) (1,75 pmól) Mintamennyiség: 0,5-1 l minta (pmól tartomány) Mérési tartomány: 100 Da pár száz kda (több is lehet!) Interferáló anyagok: Sók nagyon zavarják a mérést ZipTip/Stage Tip tisztítás Mass (m /z)

13 AnTx problémája miért nem megfelelő a rekombináns fehérje hatása? AnTx? rantx MALDI-TOF analízis MALDI-TOF analízis Hatás Hatás ~

14 % Intensity 0.4 mm tisztított AnTx spektruma Voyager Spec #1[BP = , 430] AnTx (Q forma) Da AnTx (Z forma) Mass (m /z) rantx2_0.4mm_32_2000_cal_minta_0006.dat

15 % Intensity Rekomináns AnTx refolded forma spektruma Voyager Spec #1[BP = , 97] AnTx (Q forma) AnTx (Z forma) Mass (m /z) rantx2refolded_22_2200_cal_minta_0012.dat

16 % Intensity Rekombináns AnTx - 20 mm DTT-vel redukált forma spektruma Voyager Spec #1[BP = , 481] AnTx (Z forma) Redukált AnTx (Z forma) Redukált AnTx (Q forma) Mass (m /z) rantx2dtt20mm_42_2200_cal_minta_0004.dat

17 % Intensity Rekomináns AnTx refolded forma spektruma Voyager Spec #1[BP = , 105] AnTx (Q forma) Redukált AnTx (Q forma) Mass (m /z) rantx2refolded_22_2200_cal_minta_0007.dat

18 % Intensity Tisztított rekombináns ANTX és kalibráló elegy együttes analízise 100 Voyager Spec #1[B P = , 24125] E+4 90 ACTH (1-17) 80 ACTH (7-39) ACTH (18-39) 50 Insulin (bovine) ANTX Z forma Da Mass (m /z)

19 Baktériumok gyors, tenyésztés nélküli azonosítása Bakteriológia kenet levétele baktériumok tenyésztése baktériumok azonosítása Egy/több nap Minden baktériumnak van egy csak rá jellemző, ún. spektrum-lábnyoma BioTyper (Bruker Daltonix) baktériumok és bizonyos gombák gyors analízise Minta Azonosított baktérium Adatbázis baktérium spektrumok Szoftver MALDI-TOF

20 Baktériumok gyors, tenyésztés nélküli azonosítása Dr. Szabó Judit DE OEC Mikrobiológiai Intézet Minta MALDI-TOF Dr. Csősz Éva Lábiscsák Péter Kulcsár Andrea DE OEC PSZL Szoftver készítése Dr. Emri Miklós DE OEC PET CENTRUM

21 Baktériumok gyors, tenyésztés nélküli azonosítása - munkamódszer Standard baktérium törzsek Baktérium szuszpenzió készítése Mintafelvitel: 1 µl baktérium + 1 µl CHCA mátrix Dr. Szabó Judit DE OEC Mikrobiológiai Intézet MALDI TOF analízis Spektrumok felvétele

22 % Intensity % Intensity Staphylococcus aureus baktérium MALDI-TOF spektruma Voyager Spec #1[B P = , 9996] E Mass (m /z) Voyager Spec #1[B P = , 9996] E Mass (m /z)

23 % Intensity S. aureus és H. influenzae keverék (0,75+0,25 ul arányban) MALDI-TOF spektruma Voyager Spec #1=>BC=>SM5[B P = , 1229] Mass (m /z)

24 Baktériumok gyors, tenyésztés nélküli azonosítása - munkafolyamat Új mintafelviteli módszerek Baktérium spektrumok Spektrumok reprodukálhatóságvizsgálata Nem Igen fejlesztése Baktérium spektrum Igen könyvtárak létrehozása Spektrumazonosítás Matematikai módszerek kidolgozása Dr. Emri Miklós DE OEC PET CENTRUM

25 Baktériumok gyors, tenyésztés nélküli azonosítása Biológiai minta Baktérium spektrumok Matematikai algoritmus alkalmazása Baktérium spektrum könyvtár 1 óra Baktériumok azonosítása

26 Acanthamoeba vizsgálata könny mintákban Kontaktlencse viselők körében előforduló fertőzés Szemek kivörösödését okozza, kellemetlen érzéssel, könnyezéssel, homályos látással és fényérzékenységgel jár Maradandó látáskárosodást okoz Ritka, Debrecenben évente kb. 2 eset

27 Acanthamoeba azonosítása könnymintákban - munkafolyamat Egészséges önkéntesekből származó könny Spektrumok Acanthamoeba-ra jellemző csúcsok azonosítása Acanthamoeba-val fertőzött betegekből származó könny Spektrumok Acanthamoeba tenyészet vizsgálata

28 Acanthamoeba azonosítása könnymintákban Emri Zsófia DE OEC PSZL Egészséges könnyminták Dr. Csutak Adrienn Dr. Kettesy Beáta Dr. Goran Petrovski DE OEC Szemklinika MALDI-TOF Acanthamoeba-val fertőzött könnyminták Dr. Csősz Éva Emri Zsófia DE OEC PSZL Szoftver készítése Dr. Szabó Judit DE OEC Mikrobiológiai Intézet Dr. Emri Miklós DE OEC PET CENTRUM Acanthamoeba referencia

30 ESI LC-MS/MS analízis Proxeon Easy nlc-vel kapcsolt 4000 QTRAP LC-MS/MS rendszer

31 4000 QTRAP (ABSciex) hibrid tripla kvadrupol/ioncsapda tandem tömegspektrométer Fehérje azonosítás Poszt-transzlációs módosítás azonosítása Biomarker keresés/validálás Specifikus módosulatok/fehérjék célzott kimutatása (MRM) Relatív és abszolút kvantitálás Ionforrás Detektor

32 Elektrospray ionizáció (ESI) szárító gáz (N 2 ) légköri nyomás MS analizátor minta oldat elektrospray kapilláris nagy feszültség (+) nagy vákuum többszörösen töltött ionokat eredményez nagy térfogattartományban (nl-ml) használható nyomás, feszültség és hőmérséklet gradiens szükség van szárító gázra (nitrogén) oldószer párolgás cseppek szétrobbanása [M + nh] n+ további robbanások és deszolvatált ionok keletkezése

33 Az ionok útja a kvadrupólban A kvadrupól elektródáira kapcsolt feszültség segítségével szabályozható, hogy mely ionokat enged át a kvadrupól Kvadrupól Detektor A kvadrupól szelektíven stabilizál

34 Az ionok útja az ioncsapdában Az ioncsapda stabilizálja minden bejutott ion mozgását és az elektródákra kapcsolt feszültség segítségével szabályozható, hogy mely ionokat destabilizál és enged ki Detektor Az ioncsapda szelektíven destabilizál

35 Bruker/Proxeon Easy nlc II nano HPLC

36 A top-down és bottom-up proteomikai megközelítések Top-down proteomika A fehérjéből származó MS/MS spektrumok MS/MS analízis Bottom-up proteomika Fehérjék kinyerése Tripszines emésztés MS/MS analízis Peptidekből származó MS/MS spektrumok

37 LC-MS/MS analízis sajátosságai, mintaigény 300 nl/min áramlási sebesség Víz/acetonitril gradiens Oldatban vagy gélben emésztés tripszinnel vagy más enzimmel Minták gélben vagy oldatban (acetonos kicsapás) 50 fmól (3,3 ng) BSA 1 MKWVTFISLL LLFSSAYSRG VFRRDTHKSE IAHRFKDLGE EHFKGLVLIA 51 FSQYLQQCPF DEHVKLVNEL TEFAKTCVAD ESHAGCEKSL HTLFGDELCK 101 VASLRETYGD MADCCEKQEP ERNECFLSHK DDSPDLPKLK PDPNTLCDEF 151 KADEKKFWGK YLYEIARRHP YFYAPELLYY ANKYNGVFQE CCQAEDKGAC 201 LLPKIETMRE KVLASSARQR LRCASIQKFG ERALKAWSVA RLSQKFPKAE 251 FVEVTKLVTD LTKVHKECCH GDLLECADDR ADLAKYICDN QDTISSKLKE 301 CCDKPLLEKS HCIAEVEKDA IPENLPPLTA DFAEDKDVCK NYQEAKDAFL 351 GSFLYEYSRR HPEYAVSVLL RLAKEYEATL EECCAKDDPH ACYSTVFDKL 401 KHLVDEPQNL IKQNCDQFEK LGEYGFQNAL IVRYTRKVPQ VSTPTLVEVS 451 RSLGKVGTRC CTKPESERMP CTEDYLSLIL NRLCVLHEKT PVSEKVTKCC 501 TESLVNRRPC FSALTPDETY VPKAFDEKLF TFHADICTLP DTEKQIKKQT 551 ALVELLKHKP KATEEQLKTV MENFVAFVDK CCAADDKEAC FAVEGPKLVV 601 STQTALA (50 fmól citokróm C 0,6 ng) 43% lefedettség Acetonos kicsapás, emésztés, gélből történő extrakció veszteség Keratin probléma!!!

38 Működési protokoll Minta Emésztés LC-MS/MS analízis Adatbázis keresés 2 nap 1 nap 1 nap Minimum 4 nap Minta + mintalap Eredmények és értékelés Jelentés Teljesítési igazolás

39 Kollaborációs és szolgáltatási kapcsolatok Biosystem International Kft. Kardiológiai Intézet Orvosi Vegytani Intézet Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet

41 Kétdimenziós elektroforézis Bio-Rad kétdimenziós elektroforézis rendszer IEF cella 7 cm strip 17 cm strip Pharos FX Plus szkenner Mini-PROTEAN Tetra Cell PROTEAN II xi XL Cells 24 cm strips PROTEAN Plus Multi-Casting Chamber PROTEAN Plus Dodeca Cell

42 Kétdimenziós gélelektroforézis 2DE Hatékony módszer fehérjék elválasztására Az első dimenzió az izoelektromos fókuszálás a fehérjék elválasztása a pi alapján A második dimenzió az SDS-PAGE a fehérjék elválasztása a méret alapján Alkalmas teljes proteómok vizsgálatára Legjobban sejtkultúrák vizsgálatára használható Nagyon érzékeny, nagy technikai tudást igénylő módszer Csak a legtisztább anyagokat lehet használni

43 Izoelektromos fókuszálás ph 3 ph 10 A fehérjék amfoterek, emiatt a töltésük változik a környezetük ph-jától függően Izoelektromos pont: az a ph értek, amelyen a fehérje nettó töltése nulla A fehérjék elválasztása a pi alapján történik Izoelektromos fókuszáló készülék A fehérjék vándorolnak az elektromos térben és amint elérik az izoelektromos pontjuknak megfelelő ph értéket elveszítik töltésüket és vándorlásuk megszűnik

44 méret pi

45 A gélek festése a gélben levő fehérjék láthatóvá tétele Coomassie festés (50 ng 1 g) ph 3 ph 10 4% SyproRuby festés (1 ng) Ag festés (0,1 ng) Fontos szempontok Érzékenység Linearitás Reprodukálhatóság MS kompatibilitás Költséghatékonyság Munkaigény Rendelkezésre álló szkenner 18%

46 RuBPS ruténium (II) tris (bathofenantrolin diszulfonát) festés Fluoreszcens festési eljárás Az érzékenység az SyproRuby festéshez hasonló Viszonylag egyszerű kivitelezni, olcsóbb Teljes mértékben MS kompatibilis Kiértékeléséhez speciális szkenner szükséges

47 A SyproRuby, RuBPS és Coomassie érzékenységének összehasonlítása 1. 1,5 mól 2. 0,75 mól pmól pmól 5. 1,5 pmól fmól fmól BSA M M M M SyproRuby RuBPS Coomassie PageBlue

48 A különböző proteómok kvalitatív és kvantitatív különbségeinek analízise A Minta B Minta 2DE 2DE Alkalmas a teljes proteóm vizsgálatára Minőségi és mennyiségi adatot egyaránt szolgáltat Hátrány A technikai variációk kiküszöbölésére legalább három párhuzamossal kell dolgozni Munkaigényes és vegyszerigényes

49 H. Influenzae (Kontrol) DIGE differenciál gél elektroforézis Jelölés DIGE festékkel Minták összekeverése H. Influenzae (aktinonin kezelt) 2DE E. Csosz és H. Voshol A minták összekeverésével kiküszöbölhetők az analízisek közti technikai különbségek Alkalmas a teljes proteóm vizsgálatára Minőségi és mennyiségi adatot egyaránt szolgáltat Hátrány Drága

50 Nagyhatékonyságú gélanalízis a különbségek kimutatása Progenesis (NonLinear Dynamics) Delta2D (Decodon) PDQuest (BioRad) DeCyder (GE Healthcare) Melanie... Redfin (BioRad)

51 A 2D elektroforézis során nyert gélképek összehasonlítása Delta2D szoftverrel Gélek behívása, csoportosítása Gélképek egymásravetítése (warping) Master gél készítés Expressziós különbségek analízise

52 Poszt-transzlációs módosítások kimutatására szolgáló festési eljárások Sypro Ruby Flamingo Minden fehérjét megfest ProQ Diamond Csak a foszfoproteineket festi ProQ Emerald Csak a glikoproteineket festi

53 Fehérjemennyiség mihez mennyit? Javasolt rehidráló oldat- és fehérje mennyiségek Strip hossza 7 cm 11 cm 17 cm 18 cm 24 cm Rehidráló oldat térfogata 125 µl 200 µl 330 µl 350 µl 450 µl Fehérje mennyiség ezüst festéshez 5-20 µg µg µg µg µg Fehérje mennyiség Coomassie festéshez µg µg µg µg µg

54 A fehérjék vizsgálata tömegspektrométer segítségével Fehérjét tartalmazó foltok kivágása Enzimes (tripszin) emésztés A sejt lízise 2DE Fehérjék azonosítása Tömegspektrometriás analízis

55 Nutriproteomika - funkcionális élelmiszerek előállítása Dr. Czeglédi Levente Gulyás Gabriella Állattenyésztési Intézet Se gazdag tej, tojás, hús Ideális zsírsav-összetételű sertéshús és zsír előállítása Csirkemáj proteóm Tej proteóm

56 Longevity jelleg proteomikai vizsgálata 1: longevity tehén jelenik meg tőggyulladás, lábgyulladás stb. betegségek nagyon ritkán fordulnak elő L tej/tehén Magyarországon kb. 300 db. Genetikailag nagyon összetett Proteomikai megközelítés alkalmazása Kontroll tehén szérum Longevity tehén szérum

57 Proliferatív vitreoretinopátia és a transzglutamináz 2 kapcsolatának vizsgálata 6 éves proliferatív vitreo-retinopátiás gyerek - a PVR-t vitrektómiával eltávolították Őssejtek (neurosphera) Dr. Goran Petrovski Berényi Erika TG2 KD Kontroll sejtek tápfolyadék TG2 KD sejtek tápfolyadék

58 Membránfehérjék kétdimenziós gélelektroforézise 2DE or not 2DE Plazma membrán Citoszól

60 Biomolekulák szimultán analízisére alkalmas, mikrogyöngy alapú multiplex technológián alapuló Bio-Plex rendszer bemutatása

61 Evolúció, rendszerszemléletű biológia, omikák kémcső microplate microarray Egyszerű assay egy paraméter/ analit per teszt Multiplex assay - Több paraméter per teszt

62 Luminex xmap-, FMAP-technológia - mikrogyöngy-alapú multiplex tipizálás - szuszpenziós array - akár mintánként 100 biomarker kvantitatív meghatározása egyszerre sok mintán - berendezéshez kötött, robusztus platform - kismennyiségű mintaigény, nagy áteresztőképesség - kommersz bead szettek, custom bead fejlesztés - gyors, költséghatékony, precíz platform

63 Alkalmazási területek Citokinek/kemokinek monitorozása MMP-expresszió Transzkripciós faktor analízis SNP-genotipizálás mirns-mérés Autoimmun diagnosztika HLA-tipizálás Allergológia Infektológia Obesitas Diabétesz

64 Luminex FMAP mérési elv 1. A mérés során uniform méretű (5.6 um), polisztirol mikrogyöngyöket használunk szilárd fázisként. Minden gyöngypopuláció belsőleg rendelkezik kétféle fluoreszcens festék egyedülálló kombinációjával, azaz egy-egy spektrális régiókóddal (spectral address). Precíz koncentrációkkal 100-féle színű mikrogyöngy-szett teremthető. A kis gyöngyméret megenged: - gyors kinetika - folyadékban Brown-mozgás - szuszpenziós array - óriási fajlagos felszín

65 Luminex FMAP mérési elv 2. Minden bead felszíne egy a bioesszére specifikus befogó ágenssel van burkolva. Ezek a capture reagensek lehetnek: antigének, antitestek, oligonukleotid primerek, enzim szubsztrátok, receptorok, ligandok; lehetővé téve a rendszer számára unikális gyöngy-populációk azonosítását.

66 Luminex FMAP mérési elv 3. Ezek a különböző bevonatú mikrogyöngy-populációk egyfajta master-mixként vannak összemérve a microplate minden egyes microwell-jében a mintáinkkal, létrehozva ezáltal egy olyan mérőrendszert, mely egyetlen mintából egyszerre képes többféle, multiplex analitikum meghatározására. Mintaigény: 50 ml

67 Luminex FMAP mérési elv 4. Így, minden egyes mikrogyöngy-populáció felszínén mint szilárd fázison, végbemegy egy diszkrét bioreakció.

68 Luminex FMAP mérési elv 5. Miután egy-egy mikrogyöngy befogja a megfelelő target markerét, további felszíni rétegként egy fluoreszcens festékkel jelzett riporter rendszert építünk a mikrogyöngyre.

69 Luminex FMAP mérési elv 6. Következő lépésként a gyorsan áramoltatott mikrogyöngyök átesnek egy kétlézeres gerjesztésen. Az első lézer gerjeszti az internális festékeket, azonosítva az adott mikroszféra-populációt. Egy második lézer gerjeszti a gyöngyfelszíni riporter rendszeren hordozott fluoreszcens festéket.

70 Luminex FMAP mérési elv 7. Végezetül a nagysebességű digitális jelfeldolgozók azonosítanak minden egyedi mikrogyöngyöt és kvantitálják az ezeken hordozott bioesszé eredményét, mindezt valósidőben megvalósítva 1 óra alatt 9600 mérési adat leolvasása Kalibráló görbeillesztéssel kvantitált eredmények

71 QKit QKIT ELISA vs. xmap 140 IL-6 Correlation y = x R 2 = FMAP IL-4 Rec CQkit Correlation Cell Culture y = 1,16x + 12,389 R 2 = 0, FMAP

72 Hagyományos ELISA és a Bio-Plex összehasonlítása ELISA Bio-Plex Citokinek száma Minták száma Összes adat pont lyukú lemezek száma 18 1 Adat pontok száma lemezenként Mérési idő (hr) 60 3 Minta térfogat (μl) (plazma) 50 (sejtkultúra)

73 Bio-Plex rendszer

74 Bio-Plex citokin assays humán, egér, vagy patkány citokinek sejt kultúra felülúszók, szérum, vagy plazma single, vagy multiplex gyári, vagy kívánság szerint öszeállított (x-plex) panelek jelenleg humán, 21+9 egér, vagy 9 patkány citokin Bio-Plex diagnosztikus panelek Bio-Plex Precision Pro Human Cytokine Assays Bio-Plex Pro Human Isotyping Assays New! Bio-Plex Pro Human Diabetes10-Plex Assays New! Bio-Plex Pro Mouse Diabetes 8-Plex Assays Bio-Plex Pro Human Acute Phase Assays Bio-Plex Pro Human Angiogenesis Assays

75 Bio-Plex humán citokin panel

76 RnD system * Human Cytokine Panel A * Human Cytokine Panel B * Mouse Cytokine Panel * Rat Cytokine Panel * Human MMP Panel * Human Obesity Panel * Human Adhesion Molecule Panel * Human Angiogenesis Panel A * Human Inflammation 12-Plex Kit * Human TGF-beta 3-Plex Kit * Human TIMP 4-Plex Kit * Primate 11-Plex Kit

77 R&D System humán citokin panel A

78 MILLIPLEX MAP * Cytokines/Chemokines * Cell Signaling / EpiQuant * Neuroscience * Bone Metabolism * Specialty Panels * Isotyping * Cancer Biomarker * Endocrine * Gut Hormone * Cardiovascular Disease * Toxicity * Metabolic Millipore citokin és diagnosztikus panelek MILLIPLEX MAG * Cytokines/Chemokines Magnetic Bead * Endocrine Magnetic Bead * Metabolic Magnetic Bead * Canine Gut Hormone Magnetic Bead * Toxicity Magnetic Bead

79 Általános proteomikai munkafolyamat Minta előkészítés Fehérje szeparálás Fehérjék emésztése MS mérés Peptidek elválasztása Peptid tömegtérkép Peptid szekvencia Adatbázis keresés Azonosított fehérje

80 Kollaborációk DERMINOVA COST Farm Animal Proteomics FA Action FA1002 Állattenyésztéstudományi Intézet PET Centrum PSZL Orvosi Mikrobiológiai Intézet Szemklinika Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet Kardiológiai Intézet

81 Köszönetnyilvánítás Dr. Szabó Judit Orvosi Mikrobiológiai Intézet Prof. Dr. Fésüs László Dr. Emri Miklós PET Centrum Prof. Dr. Tőzsér József Dr. Csutak Adrienn Szemklinika Kulcsár Andrea Dr. Goran Petrovski Szemklinika Lábiscsák Péter Dr. Czeglédi Levente Emri Zsófia Állattenyésztéstudományi Intézet Hevele Ildikó Köszönöm a figyelmet! Dr. Zahuczky Gábor Góczi Noémi