Rövid és hosszútávú sejtkultúrák, funkcionális tesztek. Immunológiai és Biotechnológiai Intézet Pécsi Tudományegyetem

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Rövid és hosszútávú sejtkultúrák, funkcionális tesztek. Immunológiai és Biotechnológiai Intézet Pécsi Tudományegyetem"

Gusztáv Vörös
7 évvel ezelőtt
Látták:

1 Rövid és hosszútávú sejtkultúrák, funkcionális tesztek Immunológiai és Biotechnológiai Intézet Pécsi Tudományegyetem

2 Bevezetés Definíció: az élő szervezeten kívül (in( vitro) ) tartunk élő sejteket Cél: a kísérleti állatok kímélése, ha lehetséges sejtek funkcionális vizsgálata Előny: precízen kontrollált kísérleti körülmények Kezdetek: Roux embrionális madár sejtek amnion folyadékban tartott humán bőrsejteketb

3 Osztályozás Sejt szövet, szervkultúra Rövid távú hosszú távú kultúra

4 Rövid távú kultúrák A különböző szervezetekből, szövetekből izolált sejtek 1-2 napig in vitro is eltarthatók, de proliferációt csak stimulálás után lehet kiváltani osztódás után ezek a sejtek a legtöbb esetben elpusztulnak. Néhány sejt azonban túlélhet és folyamatosan osztódhat. Néhány sejtvonal ilyen egyedi, folyamatosan osztódó, túlélő sejtekből l származik.

5 Hosszú távú kultúrák A sejtvonalak általában tumoros eredetűek. A tumoros fenotípus könnyebben alkalmazkodik az in vitro tenyésztési körülményekhez, mint a normális fenotípusú sejtek. A folyamatosan osztódó sejteknek ezen tulajdonsága a nagyobb kromoszómaszám következménye lehet. (pl chromosoma a HeLa tumor sejtvonalban).

6 Tenyésztési körülmények Teljes sterilitás! Inkubátor (állandó ~37 C C hőmérsékleth mérséklet, ~ 90 % páratartalom, pco 2 ~ 5-6 %) Tenyésztő oldat (médium) optimális ph, tápanyagok (szénhidrátok, aminosavak, nukleotidok,, vitaminok, peptidek,, hormonok, növekedési faktorok), antibiotikumok. A sejtek hosszú távú tárolása folyékony nitrogénben lehetséges.

7 Szövettenyésztő steril fülke (laminar air flow)

8 Tenyésztő edények és médium

9 Sejtvonalak HepG2 HeLa Jurkat

10 Életképesség meghatározása Festékkizárásos tesztek: Tripan kék 7-amino-actinomycin D Propidium-iodide

11 Fagociták funkcionális tesztjei Izoláció: üveg vagy műanyag m felületekhez kitapadnak Migráció: spontán, irányított (chemotaxis( chemotaxis), skin-window test Phagocytosis: nem-opszonizált (nem sepecifikus receptorok által lektinek), opsonizált (Fc receptor dependens, complement receptor dependens phagocytosis) Respiratory burst, phagoc agocyta a enzimek: NBT-teszt, myeloperoxidase, acid-phosphatase, alkalic-phosphatase, lyzozime Mediátor torok,, cytokinec tokinek: IFNg, TNFa, leukotrienek prostaglandinok, tromboxanok, histamine stb. termelés kimutatása ELISA, RIA, FIA módszerrel.

12 Phagocytosis

13 Phagocytosis

14 Phagocytosis

15 Phagocytosis

16 O 2 szabadgyök produkció

17 Limfocita funkcionális tesztek Limfociták poliklonális aktivációja: növényi lektinek (PHA, ConA), bakteriális sejtfal komponensek (LPS, dextrane-sulphate) T-sejtek funkcionális tesztje: citotoxikus aktivitás detektálása - Cr release assay NK-sejtek funkcionális tesztje: tumor sejt lízis (target sejtvonal: K562) B-sejtek funkcionális tesztje: Ig detektálás (Ig( produkció immuncitokémiával, ELISA-val, plaque-forming sejt-szám (PFC), Ig génátrendeződés dés detekció PCR-ral,, passzív kután anafilaxia (PCA) teszt

18 Limfocita funkcionális tesztek Kevert limfocita kultúra (Mixed( lymphocyte culture): Transzplantáció előtti vizsgálat Citokinek termelése ELISA, Elispot, multiplex tesztek

19 Mikrogyöngyök felhasználása multiplex mérésekben A mikrogyöngyök felhasználásában az áttörést a multiplex technika kifejlesztése jelentette: Valamilyen jellemző szerint később pontosan azonosítható mikrogyöngyök összekeverése Egyetlen méréssel több adathoz jutunk

20 Mikrogyöngyök azonosításának lehetőségei Méret alapján Fluoreszcencia intenzitás alapján Mikrogyöngybe töltött PE molekulák száma

21 Luminex xmap technológia A gyöngyöket feltöltik a speciális festék keverékkel

22 Luminex xmap technológia A különböző gyöngy klasztereket össze lehet keverni. Mivel minden egyes gyöngy egyéni felismerési jelet hordoz, az 100 xmap xmap detekciós microgyöngy rendszer klaszter detektálni tudja, hogy melyik gyöngy melyik klaszterhez tartozik. Elméletileg 100 különböző mérést lehet így egyetlen mintában egyszerre elvégezni. FL3 fluoreszcencia intenzitás FL2 fluoreszcencia intenzitás

23 Molekulák felkötése a gyöngyök felszínére Antitestek Oligonukleotidok Peptidek Receptorok Egyszerű kémiai (kovalens) kötéssekkel különböző anyagokat könnyen a mikrogyöngyök felületére lehet kötni.

24 Felhasználási lehetőségek DNS vizsgálat Immun vizsgálat Receptor-ligand vizsgálat Enzim vizsgálat

25 Luminex xmap technológia Citokinek FL3 fluoreszcencia intenzitás FL2 fluoreszcencia intenzitás

26 Luminex xmap technológia Autoantitestek FL3 fluoreszcencia intenzitás FL2 fluoreszcencia intenzitás

27 Luminex xmap technológia Kinázok FL3 fluoreszcencia intenzitás FL2 fluoreszcencia intenzitás

28 Mikrogyöngy klaszter detektálása A vörös lézer a mikrogyöngyökben található vörös és infravörös festékét is gerjeszti, lehetővé téve a gyöngy besorolását valamelyik klaszterbe a lehetséges 100 közül.

29 Detektáló paraméter detektálása A zöld lézer a mikrogyöngyök felületéhez kötődő detektáló fluorofórt gerjeszti, lehetővé téve a mintában lévő a n y a g mennyiségének meghatározását.

30 BD TM Cytometric Bead Array (CBA) Citokin mintázat detekció multiplex mikrobeadek segítségével Humán gyulladásos citokin kit

31 Humán gyulladásos citokin CBA kit Találat szám (count) Klaszterező paraméter (FL3)

32 Standard görbe kalkulálás 20 pg/ml 625 pg/ml 5000 pg/ml FL2 MFI CC

Hasonló dokumentumok

Rövid és hosszútávú in vitro immunológiai diagnosztikus eljárások

Rövid és hosszútávú in vitro immunológiai diagnosztikus eljárások 2011. / 8 Immunológiai és Biotechnológiai Intézet PTE KK Bevezetés Definíció: az élő szervezeten kívül (in vitro) tartunk élő sejteket