Mangalica specifikus DNS alapú módszer kifejlesztés és validálása a MANGFOOD projekt keretében

Átírás

1 Mangalica specifikus DNS alapú módszer kifejlesztés és validálása a MANGFOOD projekt keretében Szántó-Egész Réka 1, Mohr Anita 1, Sipos Rita 1, Dallmann Klára 1, Ujhelyi Gabriella 2, Koppányné Szabó Erika 2, Jánosi Anna 2, Zsolnai Attila 3, Egerszegi István 3, Anton István 3, Tóth Gábor 4, Molnár János 1, Stéger Viktor 4, Marincs Ferenc 4, Tóth Péter 5, Rátky József 3, Szigeti Tamás 6, Micsinai Adrienn 1 1 Biomi Biotechnológai Szolgáltató Kft. 2 Központi Környezet- és Élelmiszer-tudományi Kutatóintézet 3 Állattenyésztési és Takarmányozási Kutatóintézet 4 Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont 5 Olmos és Tóth Kft. 6 WESSLING Hungary Kft.

2 A projekt céljai: Elsődleges cél: - Egy diagnosztikai rendszer kifejlesztése és validálása mangalica minőségi és mennyiségi kimutatására élelmiszeripari termékekből Másodlagos cél: -Mangalica biobank kiépítése -A mangalica állomány széleskörű genomikai feltérképezése -Genetikai markerek keresése -A zsír kémiai összetételének vizsgálata -Az élelmiszer-ipar számára hasznos információk gyűjtése

3 MANGFOOD konzorcium Állattenyésztési és Takarmányozási Kutatóintézet Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóintézet Központi Élelmiszertudományi Kutatóintézet Olmos és Tóth Kft. WESSLING Hungary Kft. Biomi Kft.

4 Mangalica specifikus DNS alapú módszer kifejlesztés

5 Genomszekvenálási adatok Több száz ígéretes lókusz Primerek tervezése az SNP-kre elsődleges PCR szűrés Sanger szekvenálások 1 db mangalica specifikus gén 13 db sertés specifikus referenciagén Markergén PCR szűrés 1 db referenciagén V1 Referenciagén V2 Referenciagén

6 Specifitás vizsgálat Vizsgált minták Markergén Referenciagén mangalica sertés pozitív pozitív F1 keresztezett egyedek (mangalica x egyéb sertés) pozitív pozitív nem mangalica sertés negatív pozitív vaddisznó negatív pozitív egyéb állatfajok (szarvasmarha, őz, ló, rackajuh, vadnyúl, pulyka, házityúk, lúd, kacsa, fácán, lazac, magyar szürke) egyéb növényfajok (búza, burgonya, szója, rizs, feketebors, fokhagyma, kömény, kukorica, repce, takarmány, zeller) negatív negatív negatív negatív

7 Real-time PCR TaqMan technika

8 Primer optimalizálás QRT-PCR Optimalizálás Próba optimalizálás Linearitás kimutatási tartomány Hatékonyság Szelektivitás Mérés megbízhatósága Mennyiségi mérések 8

9 V1 Referenciagén -- primer koncentrációjának kiválasztása 50x50 300x50 900x50 50x x x300 50x x x x 50x50 Kiválasztott primer koncentráció: Fw: 200 nm, Rv: 200 nm 9

10 V1 Referenciagén -- próba koncentráció kiválasztása Kiválasztott próba koncentráció: 200 nm

11 V2 Referenicagén -- primer koncentrációjának kiválasztása 50x50 300x50 900x50 50x x x300 50x x x900 50x300 50x x50 900x50 Kiválasztott primer koncentráció: Fw: 50 nm, Rv: 300 nm

12 V2 Referenciagén -- próba koncentráció kiválasztása Kiválasztott próba koncentráció: 200 nm 12

13 Markergén -- Primer koncentráció kiválasztása 50x50 50x200 50x400 50x x50 200x x x x50 400x x x x50 900x x x x400 50x50 Kiválasztott primer koncentráció: Fw: 400 nm, Rv: 400 nm

14 Markergén -- Próba koncentráció kiválasztása Kiválasztott próba koncentráció: 250 nm

15 50 ng 100 ng 200 ng 1 ng Ct értékek 0,1 ng 0,01 ng V1 Referenciagén primerszett hatékonysága Hatékonyság: E=92% 42,0 41,0 40,0 39,0 38,0 37,0 36,0 35,0 34,0 33,0 32,0 31,0 30,0 29,0 28,0 27,0 26,0 25,0 24,0 23,0 22,0 21,0 20,0 y = -3,522x + 32,175 R² = 0,9952-2,50-2,00-1,50-1,00-0,50 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00

16 50 ng 100 ng 200 ng 1 ng Ct értékek 0,1 ng 0,01 ng V2 Referenciagén primerszett hatékonysága Hatékonyság: E=92% 41,0 40,0 39,0 38,0 37,0 36,0 35,0 34,0 33,0 32,0 31,0 30,0 29,0 28,0 27,0 26,0 25,0 24,0 23,0 22,0 21,0 20,0 y = -3,5181x + 32,134 R² = 0,9933 LOG Hígítás -2,5-2 -1,5-1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

17 200 ng 20 ng 2 ng Ct ÉRTÉKEK 0,2 ng 0,02 ng SNP1-3 Linearitás Markergén primerszett hatékonysága Hatékonyság: E=94% 42,0 41,0 40,0 39,0 38,0 37,0 36,0 35,0 34,0 33,0 32,0 31,0 30,0 29,0 28,0 27,0 26,0 25,0 24,0 23,0 22,0 21,0 20,0 y = -3,4785x + 32,346 R² = 0, ,5-1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 LOG hígítás

18 Mangalica specifikus DNS alapú módszer validálása

19 A nemzetközi körvizsgálatban résztvevő laboratóriumok Résztvevő laboratóriumok Real-Time PCR készülék Ország Állami kutatólaboratórium Rotor-Gene RG-3000 Magyarország Egyetemi kutatólaboratórium BioRad CFX96 Magyarország Független laboratórium ABI 7300 Magyarország Egyetemi kutatólaboratórium BioRad icycle Magyarország Független laboratórium ABI StepOne Plus Magyarország Egyetemi kutatólaboratórium ABI 7000 Magyarország Állami kutatólaboratórium ABI 7500 Magyarország Állami kutatólaboratórium Eppendorf Magyarország Állami kutatólaboratórium ABI 7500 Magyarország Hatósági laboratórium ABI 7500 Magyarország Állami kutatólaboratórium ABI 7900 Észtország Egyetemi kutatólaboratórium ABI 7300 Németország Független laboratórium ABI 7500 Németország Független laboratórium ABI 7500 Magyarország

20 Biztosított reagensek Markergén reverz primer Markergén forward primer Markergén próba Referenciagén reverz primer Referenciagén forward primer Referenciagén próba Standard (S1-S5) Ismeretlen minta jelölése F1 (mangalicaxdurok) hús menyisége % Nem mangalica sertéshús mennyisége % Mangalica tartalom % Termék U párizsi U kolbász U kolbász U kolbász U kolbász

21 Standard görbék statisztikai eredményei Referenciagén Markergén Meredekség Hatékonyság R 2 Meredekség Hatékonyság R 2 Átlag (10) -3,621 89,04% 0,997-3,601 89,69% 0,997 Szórás 0,129 0,042 0,001 0,114 0,038 0,002

22 Mangalica tartalmak eltérését a várt értéktől

23 A megbízhatóság és reprodukálhatósági értékek alapján megállapítható, hogy az általunk kidolgozott, saját fejlesztésű mangalica-specifikus TaqMan alapú real-time PCR diagnosztikai rendszer a 0-50%-os mangalica tartalom tartományban minden adatpontban megfelel az elvárásoknak.

24 Köszönöm a megtisztelő figyelmet! A MANGFOOD projekt a Nemzeti Innovációs Hivatal támogatásával valósulhatott meg, TECH_08 A3/