Humán maradványok molekuláris diagnosztikája

Átírás

1 Humán maradványok molekuláris diagnosztikája Márk László PTE ÁOK Biokémiai és Orvosi Kémiai Intézet

2

3 Antropológia módszerei Nem Életkor Elhalálozási idő Igazságügyi vonatkozások Patológiás és traumás elváltozások

4 46, XX 46, XY

5

6 Citrát-tartalom meghatározása Citrát koncentráció ( ppm) férfiak nők Életkor

7 Hormone Mass Fingerprinting Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] regint 2\0_F6\1\1Ref nő m/z férfi m/z Jámbor É.; Patonai Z.; Varga V.; Bajnóczky I.; Marcsik A; Márk L.: Hormone Mass Fingerprinting: Novel high-throughput molecular sex determination of archaeological and forensic human skeletal remains by MALDI TOF mass spectrometry, Forensic Science International (under review)

8 Antropológia módszerei Nem Életkor Elhalálozási idő Igazságügyi vonatkozások Patológiás és traumás elváltozások

9

10 Femur proximális epiphysis

11 Kollagén koncentráció Kollagén koncentráció ppm Életkor

12 Ca/P arány 2,00 1,90 1,80 Ca/P arány 1,70 1,60 1,50 1, Életkor

13 Antropológia módszerei Nem Életkor Elhalálozási idő Igazságügyi vonatkozások Patológiás és traumás elváltozások

14 Mikor halt meg K?

15 Kormeghatározási technikák Relatív módszerek Abszolút technikák

16 Abszolút technikák Radiokarbon kormeghatározás Aminosav racemizáció meghatározása Kálium-argon Urán bomlásisor alapján

17 Radiokarbon Willard F. Libby ( ) (1960 NP)

18 A kozmikus sugárzás kölcsönhatásai során keletkező neutronok radiokarbon végmagra vezető magreakciói Reakció típusa Q érték (MeV) Relatív izotóp gyakoriság az atmoszférában A magreakció egy magra vonatkoztatott gyakorisága A reakció előfordulásának gyakorisága az atmoszférában 14 N(n,p) 14 C +0, O(n, 3 He) 14 C -14,6 0,269 <1*10-2 <3* O(n,α) 14 C +1,82 9,9*10-5 0,23 3* N(n,d) 14 C -7,98 3,7*10-4 1*10-2 3* C(n,γ) 14 C +8,17 2,3*10-6 5*10-4 3* , 21, 22 Ne hasítás 1,2*10-5 1*10-2 3*10-3

19 Kozmikus sugárzás C-14 CO 2 Radiokarbon keletkezés

20 A radiokarbon mennyiségének változása a légkörben Bristlecone pine

21 Mai radiokarbon

22

23 AMS AMS (Accelerator Mass Sprctrometry) Few mg of the samples

24 Szükséges mintamennyiségek Minta típus C tartalom (%) Minimális minta mennyiség (g) proporcionális AMS faszén, tőzeg, mag *10-2 szövet, vászon *10-3 2,5*10-2 fa, tőzeg (nedves) ,25*10-1 üledék, talaj 0, * csont, fog *10-2 3*10-1 karbonát, korall, cseppkő ,5*10-2 talajvíz, rétegvíz 0, *10-2 2*10-1

25 Radiokarbon forradalom 1611-ben Usser érsek: Kr. e okt. 23 reggel 9 órakor

26 C14-es, radiokarbon-vizsgálatn1988-ban a Római Katolikus Keresztény Egyház hozzájárulását adta a C14- es eljárás alkalmazásához, kifejezve ezzel elkötelezettségét a tudományos vizsgálatok iránt. Az egymástól független három különböző egyetemen (Oxford, Zürich, Arizona) végzett eredmény ugyanazt hozta: a küldött minta alapján a lepel keletkezése1260 és 1390 közé tehető.

27 IR spektroszkópia

28 C.I. FT-IR 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0, ,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 C.P.

29 Antropológia módszerei Nem Életkor Elhalálozási idő Igazságügyi vonatkozások Patológiás és traumás elváltozások

30 Antropológia módszerei Nem Életkor Elhalálozási idő Igazságügyi vonatkozások Patológiás és traumás elváltozások

31 A csontszövet kémiai felépítése Szervetlen összetevők Makroelemek Mikroelemek Nyomelemek Szerves komponensek Kollagén Rezisztens proteinek Protein-poliszacharida komplex Citrát Lipidek

32 Posztmortem változások

33 Posztmortem változások

34 Patológiás változások

35 A klasszikus módszerek hátrányai Töredékes csontvázak vizsgálata Csontokon nem megjelenő patológiás folyamatok kimutatása Morfológiai elváltozásokat mutató nem patológiás leletek elemzése

36 A klasszikus módszerek hátrányai Töredékes csontvázak vizsgálata Csontokon nem megjelenő patológiás folyamatok kimutatása Morfológiai elváltozásokat mutató nem patológiás leletek elemzése

37 A klasszikus módszerek hátrányai Töredékes csontvázak vizsgálata Csontokon nem megjelenő patológiás folyamatok kimutatása Morfológiai elváltozásokat mutató nem patológiás leletek elemzése

38 Folyadékkromatográfia Minta Pumpa Kolonna A B Mozgófázis (eluens) Detektor (UV/VIS) UV/VIS kromatogram 38

39 Tömegspektrometria Ionforrás Analizátor Detektor Minta Tömegspektrum m/z 39

40 Ionizáció Fast Atom Bombardment (FAB) Elektrospray, Nanospray (ESI, NanoESI) Atmoszférikus kémiai ionizáció (APCI) Atmoszférikus ionizáció (API) (ESI+APCI) Termospray (TSI) Fotoionizáció (PI) Lézer deszorpciós ionizáció (MALDI, SELDI) 40

41 41

42 MALDI 42

43 Analizátor Kvadrupol Ioncspda (itrap) Repülési idő (TOF) 43

44 TOF mi = tömeg zi = töltés E = mágneses mező ti = repülési idő ls = a source hossza ld = szabad repülési úthossz e = elektron töltése (1.6022x10-19 C) 44

45 Q 45

46 Trap 46

47 47

48 48

49 49

50 50

51 m/z 51

52 m/z m/z 52

53 Precursor ion kiválasztás m/z

54 m/z leányionok 54

55 Munkamenet Protein extraction Separation nhplc on line nesi MS/MS Diagnosis 1D- or 2D SDS PAGE or DIGE Identification of ancient proteins Digestion MALDI TOF/TOF MS Peptide Mass Fingerprinting or Direct Sequencing

56 Proteinek elválasztása HPLC, nano-hplc, UPLC SDS-PAGE DIGE

57 Mennyiségi változások Kontrol minták Patológiás minták

58 Munkamenet Protein extraction Separation nhplc on line nesi MS/MS Diagnosis 1D- or 2D SDS PAGE or DIGE Identification of ancient proteins Digestion MALDI TOF/TOF MS Peptide Mass Fingerprinting or Direct Sequencing

59 Peptide Mass Fingerprinting (Mascot, Phenyx)

60 Mycobacterium tuberculosis

61 Mikolsavak analitikája Márk (2007) Folia Anthropologica 5:45-50

62

63 Régészeti minták

64

65

66

67

68 Intens. [a.u.] m/z

69

70 Paleoproteomika 68 millió éves T. rex kollagén szekvenciájának meghatározása Nielsen-Marsh et al. (2005) PNAS 102 (12):

71 Fehérjék vizsgálata Intens. [a.u.] Fehérjeforrás (csontőrlemény) homogenizálása Gélelektroforézis (12%-os SDS- PAGE) Fehérjék kivágása Fehérjék tryptikus emésztése m/z MALDI TOF/TOF Peptidek azonosítása (Mascot)

72 Bélmegyer 65

73 Csongrád 183

74 Bácsalmás 39

75 Eredmények

76 M. tuberculosis evolúciója

77 M. tuberculosis evolúciója Brosch et al. (2002) PNAS 99:

78 M. leprae Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] x m/z m/z

79

80

81 Treponema pallidum

82 60 koncentráció (ppm) Középkori szifiliszes csont ok Hg koncent rációja (n=5) A referencia mint ák Hg koncent rációja (n=10) 10 0

83

84

85 Osteosarcoma

86 Identified human proteins in osteosarcoma (Mascot score >60) Interferon alpha G Hypotetical rhabdomyosarcoma antigen Mu-RMS-40.6c DLC-1 CEP 110 protein Intracellular protein Mg11 homolog DKFZp564A032.1 Retinoic acid-induced protein 1 Dead box protein 3 Dead box helicase Dead box polypeptide 4 Nucleocapsid protein Zinc finger protein 490

87 Személyazonosítás

88

89

90

91

92 Köszönöm a figyelmet!