Lipopoliszacharidomika

Átírás

1 Lipopoliszacharidomika Kilár Anikó écsi Tudományegyetem Kémia Intézet (TTK) Bioanalitikai Intézet (ÁOK) Orvosi Mikrobiológiai és Immunitástani Intézet (ÁOK) Magyar Tudomány Ünnepe 2012

2 Bakteriális lipopoliszacharid Gram-negatív baktérium Lipopoliszacharidok sejtfal A Gram-negatív baktériumok külsı sejtmembránjában található, erıs immunrendszer-stimuláló hatással rendelkezı molekulák. szeptikus sokk kiváltói, halálozási arány 30-60%

3 World Sepsis Day (2012 szeptember) [1] Sepsis: Hall MJ et al., A. NCHS data brief, no 62. Hyattsville, MD: National Center for Health Statistics [1] MI: Yeh RW, et al., N Engl J Med, 362: , [1] Stroke: Feigin VL, et al., Lancet Neurol, 8: , [1] Cancer: [1] HIV: (2006) [2]

4 Orvosi-élettani Nobel-díj j (2011) Azonosította a bakteriális lipopoliszacharid receptorát. Bruce Alan Beutler Toll-like receptor 4 (TLR4) myeloid differenciációs faktor-2 (MD-2) LS komplex molekuláris modellje.

5 Lipopoliszacharidok ( endotoxinok ) kimutatási lehetıségei Nyúl-teszt (lázkeltés) LAL-teszt (Limulus Amoebocyta Lizátum) gélképzıdés FDA visszavonta 2011-ben ( elavult ) infúziók, dializáló oldatok és egyéb parenterális készítmények sterilitási és pirogenitási ellenırzésére használatos, rendkívül érzékeny módszerek

6 Cél: új j kimutatási módszerek m kifejlesztése se Modern analitikai eszközökkel: Kromatográfia (GC; LC) Elektroforézis (CE; mikrochip CE) Tömegspektrometria (MS; MS/MS és MS n ) Kapcsolt technikák (GC-MS, HLC-MS, CE-MS)

7 Cél: új j kimutatási módszerek m kifejlesztése se [1] A. Kilár, B. Kocsis, I. Kustos, F. Kilár, S. Hjertén: CE to monitor endotoxins by protein complexation. Electrophoresis 27, 2006, [2] A. Kilár, V. Farkas, K. Kovács, B. Kocsis, F. Kilár: Novel quantitative electrophoretic analysis of endotoxins on microchips. Electrophoresis 29, 2008, [3] A.Kilár, Z.éterfi, E.Csorba, F.Kilár, B.Kocsis: Capillary electrophoresis chips for screening of endotoxin chemotypes from whole-cell lysates. Journal of Chromatography A 1206, 2008, [4] A. Kilár, Á. Dörnyei, A. Biu, Z. Szabó, B. Kocsis, F. Kilár. Structural variability of endotoxins from R-type isogenic mutants of Shigella sonnei. Journal of Mass Spectrometry 46, 2011, [5] A. Bui, A. Kilár, Á. Dörnyei, V. oór, K. Kovács, B. Kocsis, F. Kilár. Carbohydrate Composition of Endotoxins from R-type Isogenic Mutants of Shigella sonnei Studied by Capillary Electrophoresis and GC-MS. Croatica Chimica Acta 84, 2011, [6] L. Makszin, A. Kilár,. Felsı, Z. éterfi, B. Kocsis, F. Kilár: Quantitative microfluidic analysis of S- and R-type endotoxin components with chip capillary electrophoresis. Electrophoresis 33, 2012 DOI /elps [7] A. Kilár, Á. Dörnyei, B. Kocsis. Structural characterization of bacterial lipopolisaccharides with mass spectrometry and on- and off-line separation techniques. Mass Sectrometry Reviews, 2012 DOI: /mas.21352

8 A bakteriális lipopoliszacharid (LS) molekula szénhidrát régió lipid régió S-típusú LS virulens R-típusú LS avirulens roblémák: -OLDHATÓSÁG -OTIKAI DETEKTOROK ALKALMAZÁSA

9 Mikrochip elektroforézis módszer kifejlesztése se

10 LS kimutatása mikrofluidikával Mikrochip elektroforézis fluoreszcencia detektálással (Agilent) n=0 gyors azonosítás (R/S típus) karakterisztikus profilok mennyiségi meghatározás R-LS (Salmonella) minta n=0 S-LS (E. coli) n=1 n=2 n=3 n=19 n: poliszacharid lánc ismétlıdı egységek száma [1] A. Kilár, V. Farkas, K. Kovács, B. Kocsis, F. Kilár. Novel quantitative electrophoretic analysis of endotoxins on microchips. Electrophoresis 29, 2008, 1713.

11 R-típusú lipopoliszacharidok detektálása mikrochippel Salmonella minnesota R595 Shigella sonnei R41 Shigella sonnei 4303 E.coli D31 [2] L. Makszin, A. Kilár,. Felsı, Z. éterfi, B. Kocsis, F. Kilár. Electrophoresis 33, 2012

12 S-típusú lipopoliszacharidok detektálása S.. mikrochippel Escherichia coli O S.. Salmonella minnesota wild type FU FU FU migration time (s) S.. Escherichia coli O migration time (s) 100 n=19 n=24 A baktérium azonosítása? n=18 FU migration time (s) S roteus morganii n= migration time (s) [2] L. Makszin, A. Kilár,. Felsı, Z. éterfi, B. Kocsis, F. Kilár. Electrophoresis 33, 2012

13 Tömegspektrometriás módszer kifejlesztése se (MALDI-TOF)

14 LS + Mátrix (1 µl)

15 Tömegspektrometriás vizsgálatok Készülék: Bruker Autoflex II. MALDI-TOF/TOF MS Software: FlexControl 2.4 Mátrix: 2,5-dihidroxi-benzoesav Detektálás: negatív [M-H] ionok, Da tartomány Minta: 1 mg/ml LS 0,1 M citromsavban

16 R-LS vizsgálata tömegspektrometri megspektrometriával Shigella sonnei 4303 LS MALDI-TOF tömegspektruma (negatív ion, lineár mód) (tri-acyl) (tri-acyl Kdo2 Hep 3 Hex 5 2 ) (hexa-acyl) (tetra-acyl Kdo2 Hep 3 Hex 5 2 ) (penta-acylunsat Kdo 2 Hep 3 Hex 5 2 ) (hexa-acyl Kdo2 Hep 3 Hex 5 2 ) Intens. [a.u.] Lipid Core A (Hep2 Hex ) 5 2 (tetra-acyl) (penta-acylunsat ) (Hep3Hex53) (Kdo(-CO2)Hep3Hex52) (Kdo2 Hep3Hex53) Kdo 2 Hep 3 Hex (KdoHep3Hex53) Kdo 2 Hep 3 Hex 5 2 Kdo 2 Hep 3 Hex 5 2 Kdo 2 Hep 3 Hex 5 2 Intakt LS CO 2 m/z Core régió Lipid A A Shigella sonnei R-LS vázlatos szerkezete A. Kilár, Á. Dörnyei, A. Biu, Z. Szabó, B. Kocsis, F. Kilár. Structural variability of endotoxins from R-type isogenic mutants of Shigella sonnei. Journal of Mass Spectrometry 46, 2011,

17 LS régir giók k vizsgálata külön-különk O-poliszacharid NMR GC-MS külsı core Core oligoszacharid belsı core enyhe savas hidrolízis (1-2% ecetsav, ph 3-4, 100 C, 1 óra) Lipid A GC-MS MS zsírsavak

18 A szepszist okozó Lipid A régir gió HO O OH O O 14 6' 4' 3' OH 5' 2' O 1' GlcN II O NH O O O O O HO O O O 1 GlcN I O O NH O O OH OH OH 14 OH A legtoxikusabb a fent látható E. coli típusú lipid A.

19 A biológiai hatás s függf ggése a szerkezettıl Endotoxikus Mérsékelten toxikus Inaktív [U. Seydel et al., Eur. J. Biochem. 267, 2000, 3032]

20 Lipid A vizsgálata tömegspektrometri megspektrometriával Salmonella minnesota R595 Lipid A MALDI-TOF tömegspektruma (negatív ion, reflektron mód) (tri-acylunsat ) (tri-acyl) (tetra-acyl) (tetra-acyl) (penta-acyl) (penta-acylunsat. ) (penta-acyl) (penta-acyl) (hexa-acyl) Intens. [a.u.] (hexa-acyl) (tri-acyl) m/z Tandem tömegspektrometria alapján javasolt szerkezet.

21 Tandem tömegspektrometria során lejátsz tszódó folyamatok Hexa-acil lipid A Tri-acil lipid A C14:0 zsírsav vesztés 0,2 A 2 győrőhasadás C14:1 zsírsav vesztés m/z m/z C14:0(3-OH) C14:0(3-OH) m/z m/z Di-acil lipid A C14:0 zsírsav vesztés 0,4 A 2 győrőhasadás C14:1 zsírsav vesztés m/z m/z m/z m/z A. Kilár, Á. Dörnyei, B. Kocsis. Structural characterization of bacterial lipopolisaccharides with mass spectrometry and on- and off-line separation techniques. Mass Sectrometry Reviews, 2012 DOI: /mas.21352

22 Összefoglalás A lipopoliszacharidomika területén belül a bakteriális lipopoliszacharidok (endotoxinok) szerkezetkutatásával foglalkoztunk. Sikerült új, gyors és nagy érzékenységő szerkezetmeghatározási módszereket kifejlesztenünk: kapilláris elektroforézis, mikrochip elektroforézis, tömegspektrometriás és CE-MS kapcsolt technikák alkalmazásával. A szerkezet ismerete elengedhetetlen az lipopoliszacharidmolekulák pathomechanizmusának megértéséhez.

23 Kösz Kösz szönöm szönetnyilvánítás m a figyelmet! Bioanalitikai Intézet rof. Kilár Ferenc Dr. Dörnyei Ágnes Makszin Lilla (hd hallgató) Sándor Viktor (hd hallgatóm) Orvosi Mikrobiológiai és Immunitástani Intézet rof. Kocsis Béla Biokémiai és Orvosi Kémiai Intézet Dr. Szabó Zoltán ályázatok OTKA K CEEUS HU-0010 Szentágothai Kutató Központ TÁMO B TÁMO B