Tömegspektrometriás módszerek a klinikai kémiában

Átírás

1 Tömegspektrometriás módszerek a klinikai kémiában Takáts Zoltán SE I.sz. Gyermekklinika

2 Tömegspektrometria Mi az? Ionizáció Molekulák a kondenzált fázisban Gázfázisú ionok Töltés Tömeg Gázfázisú ionok Intenzitás Tömeganalízis Tömeg / töltés

3 A tömegspektrum Egyszeres töltésű molekulaionok Intenzitás Kétszeres töltésű molekulaion Egyszeres töltésű adduktion Koncentráció! Izotópcsúcs Molekulatömeg! Tömeg / töltés

4 Tandem tömegspektrometria Első tömeganalízis Fragmentáció Második tömeganalízis Detektor A fragmentáció során keletkezett fragmens ionok m/z eloszlása szerkezeti információt hordoz, valamint alkalmas a vegyületek azonosítására is. Molekulaszerkezet felderítése Kvalitatív ill. kvantitatív analitika

5 Tömegspektrometria felhasználási területei Szerkezetkutatás általános szerkezetmeghatározás metabolizmus vizsgálatok fehérjeszekvenálás fehérjék poszttranszlációs módosításainak meghatározása Analitika Nyomnyi mennyiségben jelen levő szerves vegyületek meghatározása gyógyszerszint meghatározás anyagcseretermékek szintjének meghatározása toxikológiai alkalmazások

6 Tömegspektrometriásan vizsgálható minták Megfelelő mintaelőkészítéssel lényegében tetszőleges minta vizsgálható Minta elpárologtatás extrakció oldószercsere szűrés gázkromatográfia származékképzés folyadékkromatográfia elektroforézis... MS A tömegspektrometriában általában a mintaelőlészítés a szűk keresztmetszet Ha ezt tágítjuk, tágul az alkalmazhatóság köre A mintaelőkészítési eljárások minden esetben invazívak

7 Ionforrás Tömespektrométer Analizátor Detektor

8 Ionizációs módszerek 1. Hagyományos technikák Vákuumban történő ionizáció Gázhalmazállapotú minta GC csatolás Elektronütköztetéses ionizáció M ionok Fragmentáció Spektrumtár alapján kvalitativ analizis lehetősége Kémiai ionizáció Csak molekulaion Molekulatömeg megállapitás MS/MS segitségével szerkezeti információ Deszorpciós technikák Kondenzált fázisú minták ionizációja Nem igényli a minták elpárologtatását Nincs keresztszennyezés! SIMS Nagy sebességű primer ionsugár Jó térbeli felbontás Gyenge érzékenység MALDI Lézer Felület ún. mátrixvegyülettel boritott Gyengébb térbeli felbontás

9 Ionizációs technikák Hagyományos 1. Elpárologtatás Elektronütköztetés 2. Ionizáció elektron 70 ev Fragmentáció Csak illékony molekulák Fragmentációs mintázatból azonosítás Nem illékony molekulák csak származékként, de MW < 1000!!!!

10 GC-MS Gázkromatográfia MS detektálással Származékképzés nélkül csak illékony és termikusan stabil anyagok Származékképzés után bármilyen kis molekula EI/CI ionizáció Nagyon jó elválasztás Alkalmazási területek Környezetanalitika Élelmiszeranalitika Lipidomika (származékképzéssel) Diagnosztika Abszolút érzékenység : fg pg tartomány Lineáris tartomány akár 5 nagyságrend EI spektrumok kvalitativ analízis lehetősége Általában bonyolult mintaelőkészítést igényel Csak illékony komponensek lehetnek a mintában Származékképzés Kromatográfia Kapilláris GC, 0,1-0,25 mm ID oszlopok

11 Modern technikák Ionizációs technikák Mátrix segített lézer deszorpciós ionizáció (MALDI) lézer Tetszőleges molekuláris komponens vizsgálható (vízmolekula - egész vírus) Nem kvantitatív (Bár ) Elsősorban kvalitatív, proteomikai analízis

12 MALDI-MS Matrix assisted laser desorption ionization Általában UV (nitrogén vagy Nd-YAG) lézer, néha IR (CO 2 v. Er-YAG) lézer Mátrix általában aromás karbonsav Mintákat oldatfázisban keverjük el 1000 X X mátrixfelesleggel Tetszőleges, a mátrix tömegénél nehezebb molekula vizsgálható Elsősorban bottom-up proteomika Nem kvantitatív Érzékenység fg pg tarományban Mintaelőkészítés automatizálható - High throughput analitics Egyéb alkalmazási területek: Intakt fehérje vizsgálat Oligoszacharid és glikopeptid vizsgálatok Oligonukleotid analízis (High throughput SNP detektálás) Kémiai képalkotás (imaging) Polimer analitika

13 Ionizációs módszerek 2. Spray technikák Atmoszferikus nyomású ionizáció Folyadékhalmazállapotú minta LC csatolás Electrospray ionizáció Vezetőképes folyadék elektrosztatikus porlasztása Molekulaionok v. Komplexek Többszörösen töltött ionok Csak oldatban eleve ionként előforduló specieszek Atmoszferikus nyomású kémiai ionizáció Pneumatikus porlasztás Korona kisülés Spektrálisan hasonló a kémiai ionizációhoz Mérsékelten poláros, termikusan stabil vegyületek Egyéb technikák Atmoszferikus nyomású fotoionizáció Térdeszorpciós ionizáció Direkt ionizációs technikák DESI DART JeDI ASAP

14 Elektrospray ionizáció (ESI) Electrospray tű Csepp kialakulás Coulomb hasadás Oldószer párolgása Ion evaporáció

15 LC-MS HPLC elválasztás MS detektálással ESI vagy APCI ionizáció Általában kis molekulák (MW<5 kda) kvantitatív meghatározása Gyógyszeranalitika ADME TDM Proteomika Metabolomika Érzékenység : LLOQ ~ 1-10 pg általában Mintaelőkészítés SPE Oldószeres extrakció Kromatográfia: RP-HPLC (ESI, APCI) (NP-HPLC (APCI)) CE

16 Kvantitatív meghatározások Külső kalibráció Hígítási sor az analitból, az eredeti mátrixban A mintákkal azonos mintaelőkészítés Belső standard Kémiailag hasonló vegyület, ideálisan stabil izotóp ( 2 H, 13 C, 15 N, etc.) jelzett originális vegyület Tömegspektrométer képes szelektíven detektálni a nehéz izotóppal jelzett iont Kvantitatív meghatározásoknál mindig külső kalibráció belső standard

17 Tömegspektrometriai klinikai Gyógyszer-szintmérés Toxikológia kémiai alkalmazásai Metabolikus komponensek meghatározása Hormonok, egyéb jelátviteli komponensek meghatározása Fehérjék azonosítása Fehérjék funkcionális és szerkezeti jellemzése

18 Gyógyszerszintmérés Gyógyszermolekulák mennyiségi meghatározása Szérum, vizelet, teljes vér, liquor Szűk terápiás tartomány < 1 nagyságrend Gyors metabolizmus Nagy egyéni variancia Személyreszabott orvoslás (Personalized medicine) Immunszuppresszánsok Sirolimus, Tacrolimus, Cyclosporin A Rejekció Fertőzés Tirozin kináz inhibitorok Imatinib, Dasatinib, Gefitinib Nagy dózis potenciális vese és májkárosodás

19 Gyógyszerszintmérés - módszertan Mintaelőkészítés Fehérjementesítés Kicsapás acetonitrillel, triklór ecetsavval, etc. Ultraszűrés 3 kda-os szűrővel SPE Lipidmentesítés (csak teljes vér esetén) Extrakció kloroformmal SPE fordított fázison Extrakció Gyakran együtt a fehérje- ill. Lipidmenetsítéssel Oldószeres extrakció Szilárd fázisú extrakció (fordított fázis vagy ioncsere) Oldószercsere Minta a HPLC módszernek megfelelő összetételű és ph-jú oldószerben kell legyen

20 Gyógyszerszintmérés módszertan Gázkromatográfia tömegspektrometria Illékony vagy könnyen illékonnyá tehető gyógyszermolekulák esetén Egyes szteroidok, lipid jellegű komponensek Ritka alkalmazás, inkább doppinganalitika HPLC tömegspektrometria Általánosságban használt Lényegében bármilyen gyógyszermolekula esetében

21 Gyógyszerszintmérés - módszertan HPLC tömegspektrometria Általában fordított fázisú HPLC Oktadecil-szilika, oktil-szilika Gyógyszermolekulák általában alacsony polaritásúak Gradiens elúció 5% szerves oldószer - 95% szerves oldószer Metanol / víz, acetoniril / víz Illékony puffer, pl. ammónium acetát Gradiens végig kell menjen! (reziduális lipidek)

22 Metabolikus komponensek meghatározása Anyagcsere diagnosztika Veleszületett anyagcserebetegségek diagnosztikája Máj, ill. vesefunkció vizsgálata Kvantitatív vizsgálatok Kromatográfiával kapcsolt tömegspektrometria Általában célzott vizsgálat, pl. aminosavak meghatározása Szemi-kvantitatív vizsgálatok Közvetlen tandem tömegspektrometria Általában szűrővizsgálatok, vagy szűrővizsgálatok megerősítő vizsgálatai

23 Tömegspektrometria az endokrionológiában Szteroid hormonok meghatározása Aminosavszármazék hormonok meghatározása Peptidhormonok meghatározása

24 Szteroid hormonok meghatározása

25 Szteroid hormonok meghatározása GC-MS technikák Extrakció Kombinált származékképzés Hidroxilamin BSTFA Gázkromatográfiás elválasztás Pozitív ion EI detektálás Kvantifikálás: Stabil izotópjelzett standardokkal Érzékenység: LLOQ ~ 1-10 pg/ml Időigény: 1-1,5 h / minta 1. androsterone 2. dehydroepiandrosterone α-estradiol 4. estrone β-estradiol 6. testosterone

26 Szteroid hormonok meghatározása LC-MS/MS technikák Mintaelőkészítés Oldószeres extrakció Szilárd fázisú extrakció Fordított fázisú (oktadecilszilika) HPLC, gradiens elúció ESI vagy APCI ionizáció, pozitív ion mód Protonaffinitás problémák! Paraméterek: Kvantifikálás: izotópjelzett belső standard LLOQ: 1 pg/ml 5 ng/ml Időigény: 2-10 min/minta (1) cortisone (2) cortisol (3) 21-dexycortisol (4) cortiscosterone (5) 11-deoxycortisol (6) androstenedione (7) dexycortiscosterone (8) 17-hydroxy progesterone (9) progesterone (10) pregnenolone

27 Congenitalis adrenalis hyperplasia Számos országban része az újszülöttkori szűrőprogramnak (Magyarországon nem) Szűrés 17-OH Progesterone Immunkémiai módszerrel (ELISA) Magas fals pozitív ráta (akár 3%) Mátrix hatás, stress eredetű 17OHP emelkedés MS módszer nem jön számításba 2nd tier testing LC-MS alapú szteroid profil vizsgálat Szűrésre beérkezett szárított vércsepp mintából Lacey, J. M. et al. Clin Chem 2004;50: Egészséges Fals pozitív CAH 1. Kortizon 2. Androszténdion 3. d8-17ohp OHP

28 Katecholaminok és egyéb aminosav származékok meghatározása Kísérleti jelleggel Általában LC-MS/MS technikával Módszerek érzékenysége megfelelő, de ezek a komponensek HPLC-UV módszerrel is meghatározhatóak Példák: Adrenalin/Noradrenalin meghatározása vizeletben T3, T4 meghatározása szárított vércsepp mintában

29 Fehérjék tömegspektrometriás vizsgálata Azonosítás Emésztés tripszinnel (Tripszin Arg és Lys után vág, tehát minden keletkező peptid tartalmaz legalább egy protonálható aminosavat) Triptikus peptidek MS és MS/MS vizsgálata Adatbázis keresés Szekvencia meghatározás Átfedő peptidfragmensek szekvenálása MS/MS módszerrel Genetikai információ felhasználása (ti. részleges aminosav szekvenciához tartozó DNS szekvencia keresése) Poszt Transzlációs Módosítások Foszforiláció, glikoziláció, etc. Ismert aminosav szekvenciájú peptidek MS és MS/MS vizsgálata Enzim assay Szubsztráttal történő inkubálás Szubsztrát vagy termék visszamérése LC-MS módszerrel

30 Intakt fehérjemolekulák ESI-MS vizsgálata Információ: MW Térszerkezet Komplexképzés Mintaelőkészítés: Puffercsere 0,1 10 mm ammónium acetátra Módszer Nanospray ESSI

31 Bottom-up Tömegspektrometria proteomikai alkalmazásai 2 D elektroforézis Kivágott folt triptikus emésztése MALDI-MS v. MALDI- MS/MS (esetleg ns- MS/MS) Triptikus emésztés 2D nhplc elválasztás ESI (ns) detektálás, estleg off-line MALDI Információ: szekvencia, PTM Top-down Fehérjetisztitás SEC UF Etc. ESI ionizáció Fehérjeion izoláció a gázfázisban Disszociáció Elektronbefogás (ECD) Elektrontranszfer (ETD) Ütközéses aktiváció Infra fotonos disszociáció (BIRD v. IRMPD)

32 Kémiai képalkotás MS módszerrel Deszorpciós ionizációs technikák MALDI SIMS DeszorpciósESI Mikroszkópos metszetek vizsgálata Pixelenként veszünk fel spektrumot Pixel élhossza 5-50 um Elsősorban biomarker kutatás Lipid jellegű markerek Eicosanoidok Foszfolipidek Fehérjék, peptidek

33 Relative Abundance A MS kémiai kép Hypofizis kémiai képalkotás B Posterior lobe 500 µm Anterior lobe 500 µm Optikai kép m/z Egy adott pixelhez tartozó tömegspektrum Egér agyalapi mirigy metszet MALDI módszerrel készült kémiai képe Piros: Vazopresszin Kék: Foszfokolin Zöld: Foszfoinozitol Felbontás: 10 m Optikai kép a mérést követően készült Toluidinkék festés

34 Köszönöm a figyelmet!