9. Előadás. Fehérjék

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "9. Előadás. Fehérjék"

Endre Gulyás
5 évvel ezelőtt
Látták:

1 9. Előadás Fehérjék

2 Előzmények Peptidkémia Analitikai kémia Protein kémia 1901 E. Fischer : Gly-Gly 1932 Max Bergman és Leonidas Zervas : Benziloxi-karbonil csoport 1963 B. Merrifield : Szilárd fázisú peptid szintézis 1923 Fritz Pregl : Mikroanalitika Kromatográfia Elektroforézis Röntgen (X-ray) krisztallográfia 1952 William H. Stein és Stanford Moore : Aminosav analizis 1954 P. Edman : Protein szekvenálás 1955 F. Sanger : Az inzulin priemr szerkezete 1988 Á. Furka : Kombinatorkus peptid szintézis NMR Tömeg spektroszkópia 1962 M.F. Perutz és J. C. Kendrew A myoglobin térszerkezete

3 A peptid kötés: amid kötés (E. Fischer, 1902) Emil Fischer Nobel dij, 2002 John B. Fenn Nobel dij, 2002 N-terminális C-terminális Dipeptid: 2 Oligopeptid : 2-15 Polipeptid: >15 poliamid

4 Kötéstípusok a fehérjékben Kovalens Nem kovalens Amid Diszulfid - CO NH - - S S - Hidrofób, Van der Waals H-híd (inter és intra) Ionos

5 Fehérjék szerkezetének meghatározása 1. Izolálás, tisztítás homogén minta előállítása 2. Kimutatás, minőségi/mennyiségi meghatározás 3. Primer (elsődleges) szerkezet meghatározása - aminosavösszetétel - aminosavsorrend - N-terminális aminosav - C-terminális aminosav 4. Térszerkezet (3D) meghatározása - szekunder (másodlagos) - tercier (harmadlagos, szupermásodlagos) - quaterner (negyedleges)

6 1. Fehérje izolálás gélelektroforézis (egy- és kétdimenziós) egydimenziós kétdimenziós Salmonella thyphimurium SDS-PAGE, 200 mg protein, 3,5 x 0,8 cm Autoradigram, 2D, E. Coli proteinek, 10 mg, 14 C jelzett aminosav a táptalajban, 2,3 x 1,3 cm, exp. 825 h

7 Gélelektroforézis

8 Egydimenziós gélelektroforézis (méret szerint) HeLa sejtmag fehérjék Swiss-Prot

9 Kétdimenziós gélelektroforézis (HeLa sejtmag fehérjék) M t pi

10 2. Fehérjék kimutatása, mennyiségi meghatározása a) Amino csoport kimutatás b) Biuret próba Reagens: CuSO 4 /NaOH l = nm c) Lowry-Hartree Reagens: biuret + 3 H 2 OxP 2 O 5 x13 WO 2 x5 MoO 3 10 H 2 O, Folin-Ciocalteu-fenol l = nm d) BCA (bicinoninic acid), Reagens: biuret + BCA l = 562 nm e) Bradford reagens (trifenil-metion) l = 595 nm

11 3. Primer szerkezet Diszulfid-híd felbontása C módszer = peroxi-ecetsav mellékreakció ---Met oxidáció

12 3.1. Aminosav összetétel meghatározása Hidrolizis O O NH 2 -CH 2 - C Gly-Ala H 2 O / 6M HCl 105 o C NH-CH-COOH CH 3 NH 2 -CH 2 - glicin C + OH NH 2 -CH-COOH CH 3 alanin Elválasztás, származékképzés Ioncserés (oszlop)kromatográfia, Rockefeller Intézet, 1950 Gyanta: vízben nem oldódó polimer SO 3 - csoportokkal Detektálás: ninhidrin reakció, l = 570 nm

13 Származékképzés és elválasztás Származékképzés: o-ftálaldehid Elválasztás: HPLC, Detektálás: lg = 360 nm le = 455 nm Hunkapiller et al. Science, 1984

14 Származékképzés D/L-aminosav meghatározására NO2 NH * CH CONH2 O2N F 1-fluor-2,4-dinitrofenil- 5-L-Ala-amid (FDAA) CH3 + * H2N CH COOH Q ph 9,0; 10 perc (D,L) NO2 NH * CH CONH2 NO2 NH * CH CONH2 CH3 CH3 O2N * NH CH COOH O2N * NH CH COOH Q Q D,L-származék L,L-származék HPLC elválasztás

3. 2. Aminosav sorrend meghatározása 3.2.1. N-terminális 3.2.1.1. Sanger reakció, Nobel díj, 1958 (inzulin) és 1980 (oligonukleotid szekvenálás F. Sanger, P. Berg, W. Gilbert) F.

15 3. 2. Aminosav sorrend meghatározása N-terminális Sanger reakció, Nobel díj, 1958 (inzulin) és 1980 (oligonukleotid szekvenálás F. Sanger, P. Berg, W. Gilbert) F. Sanger (1918- ) NO 2 NO 2 O2N 4 2 F + N H 2 C H CO - R NaHCO 3 O 2 N N H C H CO - R + HF 1-fluor-2,4-dinitro benzol NO 2 N H C H CO - 6 M HCl NO 2 NH CH COOH R R O 2 N O2N + aminosavak 2,4-dinitrofenil fehérje 2,4-dinitrofenil aminosav l=254 nm Mellékreakció: Lys e-aminocsoportja

16 dimetilamino-naftalin-5-szulfonil klorid (Dansyl-klorid, Hartley, 1963) H3C N CH3 O S Cl O + C H 3 NH 2 -L-K-A-D-P-N-R-F-G-A-D-L-COOH N * C H 3 bázis ph 7,5-8,0 O S O +HCl NH-L-K-A-D-P-N-R-F-G-A-D-L-COOH * C H 3 N C H 3 6 M HCl hidrolizis O S O NH-Leu-COOH + K, A, D, P, N, R, F, G-COOH (Dansyl-aminosav) * * l g =360 nm l e =480 nm Mellékreakció: Lys e-aminocsoportja

17 C-terminális NH 2 -L-K-A-D-P-N-R-F-G-A-D-L-COOH + H 2 N - NH 2 90 o C óra + NH 3 -L CO -NH-NH 2, + NH 3 -K-CO-NH-NH NH 3 -L-COO Edman lebontás (P. Edman, Lund, 1950) 1. lépés: Reakció fenilizotiocianáttal (addició) 2. lépés: Hidrolizis 3. lépés: A feniltiohidantoin származék azonosítása

18 1. lépés: Reakció fenilizotiocianáttal N = C = S NH 2 - CH CO ph 8-9, 40 o C R S II NH - C - 2. lépés: Hidrolizis (H + /TFA) NH - CH CO -... R feniltiocarbamil származék anilinotiozolinon származék fenilhidantoin (PTH) aminosav

19 3. lépés: A feniltiohidantoin származék azonosítása

20 Fehérjék feldarabolása Kémiai hasítás a) Reakció brómciánnal (BrCN), Met - + H 2 O, H + NH 2 -CH-COOH (CH 2 ) 2 OH homoszerin

21 b) Reakció hidroxilaminnal (NH 2 - OH) Asp - Gly c) Reakció 2-nitro-4-tiociano - benzoesav - Cys O 2 N 2 HOOC 4 N = C = S Enzimatikus hasítás Terminológia (Schechter, Berger) -S4 S3 S2 S1 S1 S2 - S3 S4 enzim - P4 P3 P2 P1 P1 P2 - P3 P4 szubsztrát - P4 P3 P2 P1 OH + H- P1 P2 - P3 P4 Szerin proteázok: tripszin (Arg, Lys) P1, trombin, kimotripszin (Tyr, Trp, Phe) P1, elasztáz, kallikrein.. Cisztein proteáz: papain, actinidin... Karboxil proteáz: pepszin, katepszin D (lizoszoma), LysC (Lys) P1, GluC (Glu, Asp)... Aminoproteáz: AspN (Asp)P1... Metalloproteáz: temolizin, karboxipeptidáz A...

22 Primer szerkezet, aminosavsorrend - összegzés

23 3. Térszerkezet

24 Szerkezeti hierarchia

25 Az amid kötés Delokalizáció, 2 elektron, 3 atom - Gyenge N bázis - Erős H-híd - Részleges kettős kötés - Síkalkat - Cisz/transz izoméria Nomenklatúra

26 A Ramachandran térkép - bevezetés Omega, w Pszi, y Fi, F

27 A Ramachandran térkép

28 Másodlagos szerkezet típusai

29 Helikális szerkezet 3 10 hélix, alfa a-hélix, pi p-hélix

30 Béta redőzőtt réteg szerkezet

31 Kanyar szerkezet

32 A Ramachandran térkép - összefoglalás

34 Konformerek energiatartalma Források : kötéshossz (Ed) változatlan vegyértékszög (Eo) változatlan torziós szög (Ew) - változik Nem kötött atomok távolsága (Ew) Kötő elektronpárok kölcsönhatása (Eh) Elektrosztatikus kölcsönhatás ( Példa: DE = DEd + DEo + DEw + DEw + DEh + DEe Fehérje 100 aminosavból a) ha: 10 konformáció/as lehetséges akkor: konformer b) ha: 2 konformáció/as lehetséges akkor: konformer

35 Szupermásodlagos szerkezetek Görög kulcs Béta kígyó Csoportosítás Alfa (a) Béta (b) csak alfa hélix csak béta réteg Alfa + béta ( a + b) hélix és réteg egymástól távol Alfa/béta (a/b) hélix és réteg egymással kölcsönhatásban

36 Negyedleges szerkezet - a kollagén

37 A protemika alapjai Eredet (taxonómia) Fehérje expresszió lizis Sejtlizátum -nukleinsavak -fehérjék -lipidek -... Elválasztás (elektroforézis, UC...) Izolált fehérje Szerkezetvizsgálat (kémiai lebontás, MS.. Primer szerkezet (aminosavsorrend) Annotáció Alegységek Poszt-transzlációs Térszerkezet Lokalizáció Funkciók: fémion Kötődés, ATP kötés Rokonság más fehérjékhez Asszociáció betegséggel

38 A médium összetételének hatása az E coli fehérje összetételére Arg - Arg Farrell PHO (1978)

39 Proteomikai munkafolyamat Minta összegyűjtése Organellumok szétválasztása Tisztítás ellenanyag segítségével 1 és 2D gélelektroforézis RP-HPLC SCX HPLC (ioncserés) Fehérje gélek Fehérje(k) (pöttyök) kivágása minta Előkészítő lépések Szerkezeti vagy tömeg információk MS ESI-MS, MALDI-TOF peptidek Fehérje(k) Keresés adatbázisban Fehérje azonosítás SWISS-PROT TrEMBL RefSeq XPs Ensembl...

40 Fehérje bioszintézise

41 Nem fehérje alkotó természetes aminosavak A) H 2 N C H COOH H 2 N C H 2 C H 2 C H 2 - CO 2 Glu dekarboxiláz C H 2 C H 2 g-aminovajsav (GABA) HOOC HOOC Glu B) Lys/Met + C-vitamin (máj) C H 3 C H 3 N + C H 2 C H C H O H 3 C H 2 Karnitin Zsiranyagcsere Mitokondrium transzport Sejtpermeabilitás HOOC C) Állat, ember + H2N b a CH2 CH2 COOH Növény - béta-alanin C H 3 H O C H 2 C C H CO N H C H 2 C H 2 COOH C H 3 O H pantoténsav

42 D) H 2 N C H COOH E) C H 2 S H cisztein 1. CO 2 2. oxidáció (máj, B6) H 2 N C H 2 C H 2 SO 3 H taurin Állat Ember epesav alkotórész Növény neurotranszmitter vérlemezke + - migrén? H 2 N C H COOH (CH 2 ) 3 H N C N H 2 N H arginin argináz +H 2 O H 2 N C H COOH (CH 2 ) 3 N H 2 ornitin + H 2 N C H COOH H 2 N C N H 2 O +NH 3, + CO 2 karbamid (urea) urea ciklus (máj) hagyma, fokhagyma detoxifikáció (CH 2 ) 3 H N C N H 2 citrullin (citrullus lat. görögdinnye) O

43 F) C H 3 H N C H 2 COOH szarkozin (izom) H 2 N-CN C H 3 N H 2 C N C H 2 COOH N H kreatin. H 2 O (N-metil-guanidino-ecetsav) op: 303 o C izom H 2 PO 4 -NH - (kreatin-foszfát)

Hasonló dokumentumok

9. Előadás Fehérjék Előzmények Peptidkémia Analitikai kémia Protein kémia 1901 E.Fischer : Gly-Gly 1923 F. Pregl : Mikroanalitika 1952 Stein and Moore : Aminosav analizis 1932 Bergman és Zervas : Benziloxikarbonil