PEPTIDTÉRKÉP-VIZSGÁLAT (4)

Átírás

1 Peptidtérkép-vizsgálat Ph.Hg.VIII. Ph.Eur PEPTIDTÉRKÉP-VIZSGÁLAT (4) 01/2010:20255 A peptidtérkép-vizsgálat fehérjék, azonbelül is elsősorban az rdns technológiával előállított fehérjék esetében alkalmazott azonossági vizsgálat. Ennek során a fehérje kémiai vagy enzimatikus kezelésével peptidrészleteket (peptidfragmentumokat) hozunk létre, majd a peptidfragmentumokat reprodukálható módon elválasztjuk és azonosítjuk. A vizsgálat igen érzékeny, képes kimutatni akár egy aminosavnyi változást is, amit a komplementer DNS (cdns) szekvenciák olvasásakor kialakuló hiba, vagy pontmutáció okozott. A peptidtérképvizsgálat összehasonlító eljárás, mivel a kapott információt egy hasonló módon kezelt összehasonlító anyagéval összevetve bizonyosodhatunk meg a fehérje elsődleges szerkezetéről, detektálhatjuk a struktúrában létrejövő elváltozásokat, és így igazolhatjuk a gyártási eljárás állandóságát, valamint a genetikai stabilitást. Mindegyik fehérje egyéni sajátosságokkal rendelkezik, melyeket meg kell ismernünk, mielőtt a tudományos és analitikai megközelítések révén megfelelő specifitású peptidtérkép validált kifejlesztésére sor kerülhetne. Ez a fejezet részletes segítséget nyújt a kívánt protein jellemzése, az rdns termékekhez használt, expresszióért felelős sejtalkotók stabilitásának értékelése, a teljes gyártási folyamat állandóságának értékelése, a termék stabilitásának becslése és a fehérje azonosságának biztosítása, vagy a fehérjevariánsok jelenlétének kimutatása érdekében végzett peptidtérképvizsgálatban és annak validálásában. A peptidtérkép-vizsgálat nem egy általános módszer, hanem minden egyes fehérjéről külön specifikus térkép kifejlesztését jelenti. Bár technológiája gyorsan fejlődik, léteznek általánosan elfogadott módszerei. Ezen módszerek módosulásait, ha szükséges, az adott cikkelyek külön jelzik. A peptidtérkép a fehérje ujjlenyomataként fogható fel, s számos kémiai folyamat végtermékének tekinthető, mely a vizsgált fehérjéről széleskörű ismereteket nyújt. A vizsgálat végrehajtásához négy fő lépés szükséges: izolálás, tisztítás, ha a fehérje egy készítmény része; a peptidkötések szelektív hasítása; a peptidek kromatográfiás elválasztása; a peptidek vizsgálata, azonosítása. A minta bontását és vizsgálatát a referenciaanyaggal párhuzamosan végezzük. A peptidkötések teljes mértékű hasítása nagyobb valószínűséggel megy végbe, ha kémiai hasítóreagensek helyett enzimeket, pl endoproteázokat (tripszin) használunk. A térképnek elegendő peptidet kell tartalmaznia ahhoz, hogy értelmezhető legyen. Másrészről viszont, ha túl sok fragmentum jelenik meg, akkor a térkép elveszti a specifitását, mivel többféle fehérje is ugyanazt a képet mutathatja. IZOLÁLÁS ÉS TISZTÍTÁS Izolálásra és tisztításra a zavaró anyagokat, illetve hordozófehérjéket tartalmazó gyógyszeranyagok vagy gyógyszerformák vizsgálatakor van szükség. Ennek részleteit szükség esetén a cikkelyekben adják meg. A fehérjék gyógyszerformából történő mennyiségi kinyerését validálni kell. (4) Ez a fejezet gyógyszerkönyvi harmonizációs eljáráson esett át. Lásd 5.8 Gyógyszerkönyvi harmonizáció (9.17) c. fejezetet.

2 Peptidtérkép-vizsgálat Ph.Hg.VIII. Ph.Eur A PEPTIDKÖTÉSEK SZELEKTÍV HASÍTÁSA A fehérjekötés hasítására alkalmazott módszer megválasztása a vizsgálandó fehérjétől függ. A kiválasztás során meg kell határozni a hasítási módszer típusát enzimatikus vagy kémiai, és ezen belül a hasítószer fajtáját. Néhány hasítószer és specifitása a táblázatban található. A lista nem teljes, később az újabban felfedezett hasítószerekkel bővíteni fogjuk. A minta előkezelése. A fehérje nagyságától és konfigurációjától függően különböző mintaelőkészítési stratégiát lehet alkalmazni. Ha tripszint használunk Da-nál nagyobb molekulatömegű fehérjék hasítószereként, akkor a lizin egységeket citrakonilezéssel vagy maleilezéssel meg kell védeni, máskülönben a módszer túl sok peptidet eredményezne. Típus Enzimatikus Tripszin (EC ) táblázat - Példák a hasítószerekre Ágens Specifitás Arg és Lys C-terminális része Kimotripszin (EC ) Pepszin (EC és 2) Lizin endopeptidáz (Lys-C endopeptidáz) (EC ) Glutamil endopeptidáz (S. aureus V8 törzséből) (EC ) Hidrofób aminosavegységek (pl. Leu, Met, Ala, aromások) C-terminális része Nem specifikus ágens Lys C-terminális része Glu és Asp C-terminális része Peptidil-Asp metallo-endopeptidáz (Asp-N endoproteináz) Asp N-terminális része Kémiai Clostripain (EC ) Bróm-cianid 2-nitro-5-tio-cianobenzoesav O-jódozobenzoesav Híg sav Arg C-terminális része Met C-terminális része Cys N-terminális része Trp és Tyr C-terminális része Asp és Pro Trp BNPS-szkatol A hasítószer előkezelése. A hasítószerek, ezen belül is elsősorban az enzimek előkezelésére tisztításuk érdekében van szükség, hogy így biztosítsuk a térkép reprodukálhatóságát. Például a tripszin hasítószerként történő használatakor tozil-l-fenilalanin-klórmetil-ketonnal végzett kezelés szükséges a kimotripszin inaktiválása érdekében. Kis mennyiségű fehérje esetén más módszereket, mint például a tripszin nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás (HPLC) tisztítását, vagy az enzim gélen történő megkötését is sikeresen alkalmazzák. A fehérje előkezelése. Bizonyos körülmények esetén szükség lehet a minta koncentrálására, vagy a fehérjének a készítmény előállítása során hozzáadott anyagoktól, stabilizátoroktól történő elválasztására, ha ezek zavarják a vizsgálatot. Előkezelésre használt fizikai folyamat lehet pl. az ultraszűrés, az oszlopkromatográfia és a liofilezés. Egyéb előkezelés, mint például kaotróp szerek (pl. karbamid) adagolása is alkalmazható, abból a célból, hogy a fehérje a térképkészítés előtt legombolyodjék. Gyakran a diszulfid hidak redukálására és alkilezésére is

3 Peptidtérkép-vizsgálat Ph.Hg.VIII. Ph.Eur szükség van, hogy az enzim teljes mértékben hozzáférjen a hasítási helyekhez, illetve, hogy a fehérje magasabbrendű szerkezetét bizonyos mértékben megbontsuk. A tripszinnel történő lebontás eredményezhet némi bizonytalanságot a fehérje térképben, amit a lebontás során bekövetkező mellékreakciók, mint például a nem specifikus hasítás, dezamidáció, diszulfid izomerizáció, a metionin egységek oxidációja, vagy a peptid N- terminális végén található glutamin dezaminációja során a piroglutaminsav csoportok kialakulása okozhat. Mindezek mellett a tripszin autohidrolízise is csúcsokat eredményezhet. Ezek intenzitása a tripszin és fehérje arányától függ. Az autohidrolízis elkerülése érdekében a proteázoldatokat olyan ph-n kell készíteni, amely a folyamat szempontjából nem optimális (ez a tripszin esetében ph 5), így az enzim egészen addig nem aktív, míg a lebontó pufferrel nem elegyítjük. Az optimális lebontási körülmények kialakítása. A fehérjék lebontásának hatékonyságát és teljességét ugyanazok a tényezők befolyásolják, mint amelyek a kémiai és enzimatikus reakciókra általában hatással vannak. A reakcióközeg ph-ja. A lebontó elegy ph-ját tapasztalati úton úgy választjuk meg, hogy biztosítsuk a hozzáadott hasítószer optimális hatékonyságát. Így például bróm-cianid hasítószerként történő használatakor erősen savas körülményekre van szükség (pl. ph 2, hangyasav), míg tripszin alkalmazásakor enyhén lúgos közeg (ph 8) az optimális. Általános szabályként kimondhatjuk, hogy a reakcióközeg ph-ja nem befolyásolhatja a fehérje kémiai integritását a lebontás során, és nem változhat a fragmentáció folyamán. Hőmérséklet. A 25-37ºC-os hőmérséklet alkalmas a legtöbb lebontáshoz. Kiválasztásának szempontja a kémiai mellékreakciók csökkentése. A reakcióközeg hőmérsékletét a vizsgálandó fehérje típusa határozza meg, mivel egyes fehérjék a reakció hőmérsékletének emelkedésével érzékenyebbek a denaturációra. Például a rekombináns szarvasmarha szomatropin lebontása 4ºC-on történik, mert magasabb hőmérsékleten a folyamat közben kicsapódás észlelhető. Idő. Ha elegendő minta áll rendelkezésre, akkor megfontolandó a folyamat időfüggésének vizsgálata, annak érdekében, hogy a reprodukálható térkép létrejöttének optimális idejét meghatározzuk, s elkerüljük a nem teljes lebontást. A lebontás időtartama 2-30 óra. A reakciót fagyasztással, vagy olyan savval állítjuk le, mely nem befolyásolja a térképet. Az alkalmazott hasítószer mennyisége. Bár a viszonylagosan rövid lebontási idő (kb óra) elérése érdekében nagy mennyiségű hasító ágenst alkalmazunk, a hasítószer mennyiségét minimalizálnunk kell, hogy elkerüljük megjelenését a kromatogramon. Általában 20:1-200:1 fehérje/proteáz arány használatos. Az optimális hasítási folyamat érdekében javasolt a hasítószer 2 vagy több részletben történő hozzáadása. A végső reakciótérfogatnak azonban kicsinek kell maradna, hogy a peptidtérkép-vizsgálat következő lépése, az elválasztás gyorsabb legyen. A lebontás során keletkezett, a későbbi analízist zavaró melléktermékek hatásának kiküszöbölésére üres meghatározást végzünk a vizsgálandó fehérjén kívül az összes reagens és a lebontási kontrollvegyület felhasználásával. KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁS A fehérjék peptidtérkép-vizsgálat céljából történő elválasztására sokféle módszert alkalmaznak. A megfelelő eljárás kiválasztása a vizsgált fehérjétől függ. A fehérjék szétválasztására sikeresen alkalmazott módszerek a táblázatban találhatóak. Ebben a részben a kromatográfiás elválasztások egyikét, a leggyakrabban alkalmazott, fordított fázisú HPLC módszert ismertetjük.

4 Peptidtérkép-vizsgálat Ph.Hg.VIII. Ph.Eur Táblázat Peptidek szétválasztására alkalmazott módszerek Fordított fázisú nagyhatékonyságú folyadékromatográfia (HPLC) Ioncserés kromatográfia (IEC) Hidrofób kölcsönhatásos kromatográfia (HIC) Poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE), nem denaturáló Nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) Kapilláris elektroforézis (CE) Nagy feszültségű papírkromatográfia- (PCHV) Nagy feszültségű papír elektroforézis (HVPE) Az oldószerek és a mozgó fázis tisztasága fontos tényező a HPLC elválasztás során. A fordított fázisú HPLC vizsgálathoz a kereskedelemben kapható HPLC tisztasági fokozatú oldószerek és víz használata ajánlott. Az oldott gázok problémát okozhatnak a gradiens rendszerben, mert az oldékonyságuk az elegyben kisebb lehet, mint külön az egyik oldószerben. A gázmentesítés leggyakrabban vákuum, valamint ultrahang által keltett vibráció segítségével történik. Ha az oldószerekben lévő szilárd részek bekerülnek a HPLC rendszerbe, károsíthatják a pumpaszelepek tömítését, vagy eltömíthetik a kromatográfiás oszlop felső részét. A pumpa előtti és utáni szűrés egyaránt ajánlott. Kromatográfiás oszlop. A megfelelő kromatográfiás oszlop kiválasztása empirikus módon történik minden egyes fehérje esetén. A 10 vagy 30nm pórusnagyságú szilika oszlopok optimális elválasztást biztosítanak. Kisebb fehérjék esetén az R kromatográfiás célra szánt oktilszililezett szilikagél (3-10μm) és az R kromatográfiás célra szánt oktadecilszililezett szilikagél (3-10μm) oszlopok előnyösebbek, mint az R kromatográfiás célra szánt butilszililezett szilikagél, (5-10μm) töltetűek. Oldószerek. A legáltalánosabban használt oldószer a víz és a szerves módosítóként alkalmazott acetonitril elegye, melyhez legfeljebb 0,1%-nyi trifluorecetsavat adunk. Ha szükséges propilalkoholt vagy izopropilalkoholt is használhatunk, hogy oldjuk a lebontott komponenseket, de csak abban az esetben, ha ez nem növeli meg túlságosan a viszkozitást. Mozgófázis. Rendszerint a ph megválasztásában bizonyos flexibilitást biztosító, foszfáttartalmú, tompított mozgófázist alkalmaznak, mivel a ph 3-5 tartományban a ph kis változtatása javíthatja a savas egységeket (pl. glutaminsav, aszparaginsav) tartalmazó fehérjék elválasztását. Nátrium, vagy kálium-foszfát, ammónium-acetát, illetve foszforsav szintén használható a ph 2-7 (polimer hordozók esetén magasabb) ph tartományban acetonitril gradiens mellett. Trifluorecetsavat tartalmazó acetonitrilt is gyakran alkalmaznak. Gradiens. A gradiens lehet lineáris, nem lineáris, vagy lépcsőzetes. A komplex elegyek elválasztására kis gradiensek ajánlottak. A gradienseket úgy kell optimalizálni, hogy egy vagy két, a későbbiekben jelzőcsúcsként használt csúcs felbontása a lehető legjobb legyen. Izokratikus eluálás. Az izokratikus HPLC rendszer az egyszerűség és a jobb detektálás érdekében egyetlen mozgófázist alkalmaz. Az egyes csúcsok jó felbontásához szükséges optimális mozgófázis összetételt néha nehéz kialakítani. Izokratikus HPLC rendszerekben olyan mozgófázisokat, melyeknél a komponensek arányában, vagy a ph-ban bekövetkező enyhe változások is jelentősen befolyásolják a fehérjetérképen megjelenő csúcsok retencióját, nem szabad használni. Egyéb paraméterek. A vizsgálatok jó reprodukálhatóságához általában szükséges az oszlop hőmérsékletének szabályozása. A mozgófázis áramlási sebessége a 0,1-2,0 ml/perc tartományban van, a fehérjék detektálása pedig UV detektorral történik nm-en. Egyéb detektálási módszerek is léteznek ugyan, (pl. oszlop utáni származékképzés) azonban ezek nem olyan robusztusak, mint az UV detektálás.

5 Peptidtérkép-vizsgálat Ph.Hg.VIII. Ph.Eur Validálás. Ez a rész a vizsgálati módszer átfogó teljesítményének mérésére szolgáló gyakorlati lehetőségeket mutatja be. A rendszeralkalmassági követelmények az adatok kiértékelését és elfogadását befolyásoló kritikus vizsgálati paraméterek felismerésétől függnek. Az ilyen kritikus paraméterek megtalálása a peptidanalízisnek és a fehérje-lebontás monitorozásának is fontos követelménye. A kívánt mértékű lebontás végpontjának elérését a vizsgálandó fehérjével azonos módon kezelt referencia mintával történő összehasonlítással igazoljuk. A vizsgálandó fehérjével párhuzamosan vizsgált referenciaanyag fontos szerepet tölt be a rendszeralkalmassági követelmények kialakításában, továbbfejlesztésében. További összehasonlítás céljából a referenciaanyaghoz mintakromatogramot is csatolnak. Egyéb indikátora lehet a lebontásnak a fehérje vagy peptid oldékonyságának, illetve az intakt fehérje hiányának vizuális megfigyelése, illetve egy, a lebontást indikáló peptid jelének mérése. A peptid analízis kritikus rendszeralkalmassági paraméterei az adott peptid elválasztásának és detektálásának módjától, valamint az adatelemzés követelményeitől függnek. Amikor a peptidtérkép-vizsgálatot azonosításra használjuk, rendszeralkalmassági követelmény az azonosított fehérjékre vonatkozó szelektivitás és pontosság. Ebben az esetben, valamint amikor fehérjevariánsok azonosítását végezzük a peptidtérképen, a megjelenő fragmentumok primer szerkezetének meghatározása egyrészt megerősíti az ismert primer szerkezetet, másrészt - az adott fehérje referenciaanyag peptidtérképével történő összehasonlítás útján lehetővé teszi a fehérjevariáns azonosítását. A peptidfelbontás meghatározásának egyik lehetősége a lebontott referenciaanyag alkalmazása. A fehérjevariánsok analízise során az adott változat és a referenciaanyag megfelelő elegyét alkalmazhatjuk, főleg ha az adott peptidvariáns a térkép rosszabb felbontású részén található. A mintázat állandóságának jellemzésére egyszerű esetben a detektált főbb fehérjék száma használható. A fehérje mintázatának állandósága legjobban a peptidcsúcsok felbontásával definiálható. A peptidfelbontás megadására alkalmas kromatográfiás paraméterek például a valamennyi szomszédos csúcsra megadott csúcsfelbontás, a maximális csúcsszélesség, a csúcsterület, az uszályképződési (tailing) faktorok, valamint az oszlophatékonyság. A vizsgálandó proteintől, és a elválasztási módszertől függően egy vagy több peptidfelbontási követelményre lehet szükség. A vizsgálandó protein referenciaanyagának lebontásakor létrejövő termék többszöri párhuzamos vizsgálata alapján állapítható meg a módszer pontossága és a visszanyerés. Az azonosított peptidek mennyiségi visszanyeréséről általában külső vagy belső peptidstandardok segítségével lehet meggyőződni. A pontosságot a relatív szórással (RSD) fejezzük ki. Az azonosított fehérjék visszanyerésében és a pontosságban fellépő eltérésekre számítanunk kell, ezért mindkét paraméterre rendszeralkalmassági határokat kell bevezetni. Ezek a határok az adott fehérjékre jellemző egyéni paraméterek, melyeket a cikkelyekben adnak meg. Először a relatív retenciók, a csúcsjellemzők (csúcsterület, csúcsmagasság, csúcsok száma) és a teljes elúciós kép összehasonlítását vizuálisan végezzük, majd kiegészítjük és megerősítjük a csúcsarányok matematikai elemzésével, valamint a lebontott minta és referenciaanyag 1:1 arányú elegyének (V/V%) kromatográfiás profiljával. Ha a lebontott mintában és a lebontott referenciaanyagban a csúcsok relatív retenciója és csúcsarányai azonosak, akkor a vizsgált minta azonossága megerősítést nyert. Ha a kezdetben jelentős relatív retenció különbséggel megjelenő csúcsok az 1:1 arányú elegyben egyetlen csúcsként jelentkeznek, akkor a kezdeti különbségek betudhatók a rendszer variabilitásának. Ha viszont az 1:1 arányú elegyből elkülönült csúcsokat detektálunk, az azt bizonyítja, hogy az azokat létrehozó peptidek nem azonosak. Ha az 1:1 arányú elegy kromatogramján megjelenő csúcs jóval szélesebb, mint a neki megfelelő csúcs a mintában és a lebontott anyagban, akkor ez különböző peptidek jelenlétét valószínűsíti. A számítógépes mintázatfelismerő programok használatát javasolják és alkalmazzák is, de a validálásával kapcsolatos problémák egyenlőre kizárják ezek a gyógyszerkönyvi vizsgálatokban történő

6 Peptidtérkép-vizsgálat Ph.Hg.VIII. Ph.Eur alkalmazását. Egyéb matematikai képleteket, modelleket, és mintázatfelismerő automatizált módszereket is alkalmaznak. Ilyen eljárások például a vegyületek IR spektroszkópiával történő automatizált azonosítása, vagy a diódasoros UV spektrum analízis alkalmazása a peptidek azonosítására. E módszereknek is vannak korlátaik, melyek például a nem megfelelő felbontásból, egyes fragmensek együttes eluálódásából, valamint a lebontott referenciaanyag és mintafragmentumok abszolút csúcsnagyságai között mutatkozó különbségekből erednek. A peptidtérképen megfelelően azonosított és kiválasztott fontosabb csúcsok esetén elvégezhető a csúcsok retenciós idejének, területének, vagy magasságának számszerű összehasonlítása. A csúcsok területei kiszámíthatók egy viszonylag kis variabilitást mutató csúcs belső referenciaként történő alkalmazásával, de szem előtt tartva azt, hogy a terület integrálása igen érzékeny az alapvonal változásaira, ami a vizsgálatban hibát eredményezhet. Más esetekben a csúcsmagasságnak és az összes csúcsmagasság összegének arányát számítjuk ki. A százalékos arányt ezt követően a megfelelő referenciaanyag csúcsával hasonlítjuk össze. A tripszin autohidrolízisének lehetőségét egy üres az üres oldat tripszinnel történő kezelése után nyert peptidtérkép segítségével vizsgáljuk. A peptidtérkép-vizsgálat minősítésének minimális követelménye egy olyan elismert vizsgálati eljárás, mely a vizsgálat ellenőrzése céljából rendszeralkalmassági vizsgálatot tartalmaz. A hatósági folyamat kezdetekor általában elegendő a peptidtérkép-vizsgálat valamely fehérjére történő minősítése. Ahogy a hatósági engedélyezési folyamat előrehalad, további minősítési vizsgálatokat végeznek. Ilyen például az eljárás részleges validálása, melynek célja annak bizonyítása, hogy a módszer az adott fehérjére úgy fog működni, mint ahogy azt az adott fehérjetérkép kifejlesztésekor tervezték. PEPTIDEK VIZSGÁLATA ÉS AZONOSÍTÁSA Ez a fejezet segítséget nyújt a hatósághoz benyújtott kérelmek alátámasztására szolgáló peptidtérkép-vizsgálat kifejlesztésében. A peptidtérkép kvalitatív alkalmazása nem igényli valamennyi peptidcsúcs azonosítását. Ugyanakkor a hatósághoz benyújtott kérelmek alátámasztására szolgáló peptidtérkép-vizsgálat validálása szükségessé teszi a peptidtérképen található mindegyik csúcs pontos azonosítását. A csúcsok jellemzésének módszerei az egyes csúcsok peptidjeinek N-terminális lebontásától, majd ezt követő aminosav analízisétől a tömegspektrometriáig (MS) terjednek. Ha karakterizációs célból N-terminális lebontást, és aminosav analízist alkalmazunk, akkor az analitikai elválasztás méretét arányosan megnöveljük. Mivel a méretnövelés befolyásolja a peptidcsúcsok felbontását, ezért empirikus adatokkal igazolni kell, hogy nincs felbontási veszteség. Ha szükséges, a peptidcsúcsoknak megfelelő eluált anyagokat összegyűjtük, vákuummal koncentráljuk és újra kromatografáljuk. A fragmentumok aminosavanalízisének a fehérje mérete szab határt. Ha az N-terminális rész blokkolva van, akkor a szekvenciavizsgálat előtt szükséges ennek megszűntetése. A fehérjék karboxipeptidázzal végzett C-terminális lebontása, és a repülési idő analizátorral kombinált mátrix segített lézer deszorpció/ionizáció (MALDI-TOF) szintén felhasználható azonosítási célra. A tömegspektrométer alkalmazása peptidrészletek jellemzésére történhet az izolált peptidek közvetlen bejuttatása révén, vagy szerkezetvizsgálatra kifejlesztett kapcsolt LC-MS segítségével. Ez a technika általában elektromos porlasztást (ES), MALDI-TOF-MS rendszert, ill. gyors atombombázásos ionizációt (FAB) alkalmaz. Módosított fehérjék szekvenciaelemzésére, és az aminosav módosítás típusának meghatározására tandem tömegspektrométer is használható. A redukció előtti és utáni tömegspektrumok összehasonlítása

7 Peptidtérkép-vizsgálat Ph.Hg.VIII. Ph.Eur lehetőséget biztosít annak meghatározására, hogy a több tiolcsoportot tartalmazó peptid mely csoportjai között alakulnak ki diszulfid hidak. Ha a primer szerkezet egyes régióit a peptidtérkép nem bizonyítja egyértelműen, akkor szükséges lehet egy második peptidtérkép létrehozása. A peptidtérkép-vizsgálattal végzett validált fehérjekarakterizálási folyamat célja, hogy a teoretikus fehérjeszerkezetnek legalább 95%-áról számot adjon.