Sörminták aminosavtartalmának meghatározása nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiával (HPLC) Gyakorlat a Kémia BSc Elválasztástechnika tárgyához

Átírás

1 Sörminták aminosavtartalmának meghatározása nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiával (HPLC) Gyakorlat a Kémia BSc Elválasztástechnika tárgyához A gyakorlat célja: Kereskedelmi forgalomban kapható magyar sörminta aminosavtartalmának meghatározása HPLC-vel, o-ftálaldehid (OPA)+3-merkapto-propionsav (MPA) származékképzőszerek alkalmazásával, szimultán UV és fluoreszcenciás detektálással 1, Az aminosavak elemzésének kromatográfiás lehetőségei A szabad- és fehérje hidrolízátumok aminosavtartalmának minőségi-mennyiségi meghatározása, a modern biokémia, orvostudomány, genetika, taxonómia, élelmiszeripar, vegyipar és gyógyszeripar számára alapvetően nélkülözhetetlen. A napjainkban leggyakrabban alkalmazott aminosav meghatározási technikák, biológiai mintákban: Vékonyréteg kromatográfia (TLC, HPTLC és OPTLC) Ioncsere folyadékkromatográfia (IEC - automatikus aminosav analizátor) Gázkromatográfia (GC) Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) Kapilláris elektroforézis (CE) 2, Aminosavak meghatározása HPLC módszerrel Az elmúlt negyven évben a folyadékkromatográfia nagymértékű fejlődésével korlátlan lehetőségek nyíltak a preparatív- és analitikai kémiai célú aminosav elemzések előtt. A modern, nagyteljesítményű HPLC módszerek elterjedésével, a detektálási lehetőségek bővülésével, az egyre jobb minőségű és szélesebb választékú kromatográfiás oszlopok alkalmazásával és a számítástechnika nagymértékű előretörésével az adatgyűjtés és adatfeldolgozás területén, az elemzési költségek és idők nagymértékű csökkenése volt tapasztalható. Mindezen tényezők ugrásszerűen növelték a kutatások és gyakorlati alkalmazások fejlődésének ütemét is. Az aminosavak HPLC elemzésének három nagy területét különíthetjük el, úgymint:

2 1, Származékképzés nélküli elválasztás: - IEC és fordított fázisú ionpár-kromatográfia (RP-IP-HPLC); - tömegspektrometriás detektor (MS) alkalmazása. 2, HPLC oszlop utáni származékképzés: - külön reaktorteret igényel: - IEC és RP-HPLC módszer: - ninhidrin, fluoreszkamin, OPA+tiol, vagy 4-fluoro-7-nitrobenzorazán (NBD-F) származékképzőszer alkalmazása. 3, HPLC oszlop előtti származékképzés: - RP-HPLC, sokféle származékképzőszer; - ultraibolya (UV)- és fluoreszcenciás detektorok (Fl) alkalmazása. A HPLC módszerrel történő aminosav elemzések körében az oszlop előtti származékképzés a legelterjedtebb. Népszerűségét a rendelkezésre álló származékképzőszerek sokféleségével, a fordított fázisú oszlopok eredményezte hatékonyabb elválasztásokkal és az általánosan használt, ugyanakkor megfelelően érzékeny detektorok (UV, Fl) alkalmazásával magyarázhatjuk. Ezen technikák felhasználását az teszi lehetővé, hogy a származékképző csoportok egyszerre hidrofóbok és kromofórok, így nagy mértékben növelik a retenciós tényezőket mely főleg a poláris aminosavak elválasztásában döntő szerepűek, illetve a detektálás érzékenységét is javítják. A származékképzőszerek színes választéka ugyanakkor azt is sugallja, hogy egyik módszer sem tökéletes a felhasználók általában a célfeladat és a rendelkezésre álló műszereik alapján választanak, ezért napjainkban is újabb és újabb lehetőségek után folynak kutatások. Az ideális származékképzőszernek a következő tulajdonságokkal kellene egyidejűleg rendelkeznie: 1, gyors és kvantitatív reakciót adjon az aminosavakkal, lehetőleg vizes közegben; 2, stabil származékot képezzen; 3, mind az első-, mind a másodrendű aminosavakkal reagáljon; 4, feleslege és esetleges mellékreakciói ne zavarják a kromatográfiás elválasztást; 5, egy kromatográfiás csúcsban eluálodó származékot adjon; 6, megfelelõ érzékenységgel és szelektivítással mérhető, lehetőleg fluoreszkáló származékot képezzen. Az elmúlt évek irodalmi adatait tekintve, megállapítható, hogy a legtöbbször alkalmazott származékképzőszer az OPA+tiol (72.5%-a az összes HPLC elválasztásoknak, 1992 és 1998 között). Ezt követik a fenil-izotiocianát (PITC) és a 9-fluorenil-metil-kloroformát (FMOC-

3 Cl), illetve az egyre kisebb jelentőségû 4-dimetil-amino-azobenzol-szulfonil-klorid (DABSYL-Cl) és az 5-dimetil-amino-naftalin-1-szulfonil-klorid (DANSYL-Cl) alkalmazások A gyakorlat során OPA+MPA reagenst használunk a származékkészítéshez (1. ábra) és biner gradiens rendszert alkalmazunk az elúció során (1. táblázat). CHO S R + NH 2 CH R + R SH N CH R + 2H 2 O CHO COOH COOH OPA aminosav tiol izoindol-aminosav 1. ábra Primer aminosavak származékképzése OPA+tiol vegyületekkel, tiol= MPA; COOH(CH 2 ) 2 SH 1. táblázat Gradiens program OPA/MPA gradiens program Lépcső Idő Áramlási sebesség A B (perc) (ml/perc) (%) (%) 1 0,00 1,3 99,5 0,5 2 6,00 1,3 99,0 1,0 3 8,00 1,3 97,0 3,0 4 9,00 1,3 93,0 7,0 5 11,00 2,3 85,0 15,0 6 12,00 2,3 81,0 19,0 7 16,00 2,3 72,0 28,0 8 19,00 2,3 72,0 28,0 9 22,00 2,3 65,0 35, ,00 2,3 0,0 100, ,00 2,3 0,0 100, ,00 2,3 99,5 0, ,00 2,3 99,5 0,5 (A) eluens: 0,05 M-os nátrium-acetát oldat tetrahidrofurán (99:1), ph=7,2 (B) eluens: 0,10 M-os nátrium-acetát acetonitril metanol elegy (46:44:10), ph= 7,2 A megfelelő ph-értékű oldatokat jégecet, illetve 50%-os nátrium-hidroxid, valamint ezek hígított oldatainak cseppenkénti adagolásával állítjuk elő.

4 Készülék Waters 600-as vezérlő négyfejes pumparendszer, alacsony nyomású mixerrel Waters 717 automata mintaadagoló termosztálható oszloptartó Waters 996 fotodiódasoros (PDA) detektor sorba csatlakoztatott Waters 274 fluoreszcens detektor Oszlop Hypersyl, C18, 5 µm, 200 mm 4 mm + előtét oszlop Származékképzés OPA/MPA reagensoldat: 5,0 ml metanolos OPA oldat (0,500g OPA/25 ml metanolban oldva)+20,0 ml borát puffer {(0,2 M bórsav és 0,2 M kálium-klorid - 0,2 M NaOH (50:50, ph=9,90)}+ 50 µl MPA oldat, ph = 9, µl mintaoldathoz 120 µl OPA/MPA reagens adagolása. A kapott elegyet alaposan összekeverni, majd 10 C-on tartva 20 µl-ét injektálni. Detektorok A mérések során a PDA és Fl detektorokat ebben a sorrendben sorba kapcsolva alkalmazzuk, így egy kromatográfiás felvételről egyidejűleg kétféle kromatogramot, illetve szükség esetén UV spektrumokat is rögzíthetünk, lsd. 2. ábra, glicin és γ-aminovajsav (GABA) kromatogramja. A spektrumokat nm hullámhosz tartományban vesszük fel, 4,8 nm-es felbontással. A származékképzés során keletkezett izoindolvegyületek fluoreszcenciás válaszjelét 337 nm-es gerjesztési (ex)- és 454 nm-es kibocsátási hullámhosszaknál (em.) mérjük. Az OPA/MPA származékok fluoreszcenciás intenzitása egy nagyságrenddel nagyobb, mint a maximális UV elnyelésnél kapott (334 nm) abszorbancia értékek, ugyanakkor a teljes spektrum felvétel lehetőséget nyújt a kromatográfiás csúcsok tisztaságának nyomon követésére, esetleges koelúciók kizárására. A Fl intenzitás és az UV elnyelés hányadosával képzett válaszjel arány az aminosavak minőségi azonosítására is alkalmazható.

5 Glicin GABA 2. ábra Glicin (t R = 6,48 perc) és GABA (t R = 7,40 perc) különböző koncentrációjú OPA/MPA származékainak kromatogramja Fl detektor alkalmazásával és UV spektrumai ( nm) Mérés menete 1, Eluensek előkészítése A és B eluensek összeöntése, ph beállítása, szűrés, szonikálás, He gázzal átbuborékoltatás (sparge) 2, Származékképzőszer oldatának összeöntése 3, Pumpák légtelenítése 4, Autosampler légtelenítése (purge) 5, Oszloptermosztát hőmérsékletének beállítása, 50 0 C-ra 6, Oszlop ekvilibrálása 7, Számítógépes szoftver elindítása (Millenium Session Manager elindítása, User Name: Demo beírása és Log in, Gyakorlat mappa kiválasztása, gradiens módszer kiválasztása (OPAMPA gyakorlat), belépés a Quick Set ablakba, Setup instrument, majd Monitor Baseline alkalmazása. 8, Stabil nyomás és alapvonal jel esetén standard minta injektálása 2x (pontos összetétele a gyakorlaton lesz megadva), külső kalibrálás alkalmazása. 9, Sörminta mérése 2x. Jegyzőkönyv 1, Mérés rövid leírása 2, Standard oldatok és sörminták kromatogramjai 3, Számolás külső kalibrációval 4, Eredmények megadása táblázatos formában, mg/l koncentrációban számolva.

6 Kötelező irodalom: A Műszeres Analitika előadás HPLC-s tételeinek ismerete (A HPLC rendszer felépítése: szivattyúk, gradiens képzők, injektorok, oszlopok. Álló- és mozgófázis jellemzése az NPés RP-HPLC technikáknál. Gradiens elúció, Szerves módosítok és a ph szerepe az elválasztásban. Detektorok; UV/VIS, fluoreszcenciás.) Ajánlott irodalom: A sörfőzés lépései Gerecs Árpád: Bevezetés a kémiai technológiába, Sörgyártás fejezet, oldalak