Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia

Átírás

1 Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia High Pressure Liquid Chromatography High Precision Liquid Chromatography High Performance Liquid Chromatography

2 A kromatográfia hasonló kémiai szerkezetű vegyületek térbeli elkülönítésére, mennyiségi és minőségi jellemzésére szolgáló elválasztástechnika. Réteg kromatográfia tól 1950 Gázkromatográfia (Martin és Synge) 1959 Gélkromatográfia Folyadékkromatográfia 1970 Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia

3 Detektálási tartomány preparatív ( g kg) félpreparatív (mg g) analitikai (mg/ml pg/ml)

4 A módszer működésének alapja: a mozgófázisba (eluens) kevert mintaelegyet szoros kontaktusba hozzuk egy azzal nem elegyedő állófázissal. A mozgófázis lehet gáz, vagy folyadék, míg az állófázis egy lapra felvitt, vagy cső belsejében rögzített folyadék vagy szilárd halmazállapotú anyag. Az eluenst állandó mozgásban tartva a minta komponensei az állófázissal való kölcsönhatásuk különböző mértéke miatt elkülönülnek egymástól.

5 Adott komponens meghatározásának alapfeltétele: oldékonyság az eluensben és detektálhatóság Normál fázisú elválasztás az állófázis poláros, a mozgófázis apoláros (a poláros komponens kötődik jobban az állófázishoz). Elválasztás alapja: adszorpció Lipofil anyagok: olajok, zsírok, lipidek Eluens: Alkoholok, Kloroform, n-hexan, Heptán Fordított (reverz) fázisú elválasztásnál az állófázis apoláros (C-18) és a mozgó fázis poláros (víz-metanol) Elválasztás alapja: adszorpció, deszorpció Legtöbb biológiai anyag: fehérjék, peptidek, amino savak, monoaminok, nuklein savak Eluens: vizes puffer, metanol, acetonitril, adalékanyagok (ionpárképzők)

6 Tulajdonság Az elválasztás alapjai Töltés Méret Ligand specificitás Molekula szerkezet Metodika Ioncserélő kromatográfia Gélfiltráció Affinitás kromatográfia Kiralitás Minta Szervetlen ionok, Savak, bázisok Fehérjék, nukleinsavak, polimerek Fehérjék, enzimek Enantiomerek Eluensek Vizes puffer Vizes puffer, Szerves oldószer Vizes puffer, adalékok Vizes puffer, Szerves oldószer

7 Kromatogram: a detektorjel idő függvényében való ábrázolásakor a mintakomponenseket reprezentáló csúcssorozat. Retenciós idő: a mintának a mozgófázisba juttatásától (injektálás) a komponens detektor által mért maximális koncentrációjának (a megfelelő csúcs maximális értékének) a megjelenéséig eltelt idő. A retenció az egyes komponensek anyagi minőségével, szerkezetével függ össze. Alapfogalmak I.

8 Alapfogalmak II. Felbontó képesség (resolution) V 1, V 2, = retenciós idők W 1, W 2 = csúcsszélesség

9 Alapfogalmak III. Kimutathatósági határ 3:1 jel/zaj referencia anyaggal Mérési alsó/felső határ: validált legkisebb, legnagyobb kalibrációs pont Lineáris tartomány egységnyi koncentráció változás állandó jel-változást idéz elő Dinamikus tartomány koncentráció változás jel-változást idéz elő

10 Csúcs kiszélesedés Peak broadening

11 Tailing

12 Elválasztási módok Gradiens elúció fajtái Lineáris Gradiens Lépcsőzetes Függvény szerinti Izokratikus

13 Állófázis Mechanikai stabilitás Kicsi, homogén töltetátmérő (jobb elválasztás) Energetikai homogenitás (visszatartásért felelős helyek homogén eloszlása) C-4, C-8, C-18 Szilika-alapú reverz fázisú töltet ph 7.5 alatt Szintetikus szerves polimer: polisztirén ph 1-12

14 Oszlop (analitikai, előtét) Oszlop hardwer, acél, vagy PEEK Hossz 5-30 cm Átmérő Preparatív mm Félpreparatív 20 mm Analitikai 3.0, 4.0, 4.6 mm Mikrobore 1.0, 2.0 mm Kapilláris oszlopok μm

15 Elméleti tányérszám Elméleti tányérmagasság: az az oszlop szakasz, ahol az egyensúlyi koncentráció kialakul a mozgó és az állófázis között Elméleti tányérszám: N = 16 (tr/w) 2 Minél nagyobb N, annál hatékonyabb az elválasztás

16 Eluens tároló és Degassing rendszer Pumpa/pumpák, pulzálás csillapító Mintaadagoló rendszer (injektor/autosampler) Oszlop (előtét analitikai) Oszloptermosztáló rendszer Detektor (Frakciókollektor) Jelfeldolgozás HPLC rendszer

17 Pumpa típusok kiszorításos pumpa: achát dugattyúk, 2 alternáló pumpa dugattyús fecskendő típusú

18 Pumpa: mire figyeljünk? Számítógép vezérlés Pulzálásmentes áramlás ml/perc mellett pulzálás csillapítás: hosszú cső membrán acélgolyók Magas nyomás: bar, nano HPLC bar tömítés C-porral dúsított teflon titán rugó achát dugattyú Korrozíótűrő: titán, rozsdamentes acél Könnyű légtelenítés visszacsapó szelep: achát gyűrű, rubin golyó

19 Manual injektor Injektor Autosampler

20 Mire kell figyelni? Számítógép vezérlés Programozható (származékképzés) Mintatálca hűthető legyen Pontosság Fénytől védhető legyen (vagy a vial) Átszennyezés (tű átmosása)

21 Hűtés, fűtés Stabilitás Oszloptermosztálás

22 Detektorok Komponensek vagy mozgófázis tulajdonságát észlelik UV-VIS (ultraibolya-látható) elektrokémiai ECD fluoreszcens FLD tömegszelektív MSD radiokémiai RD törésmutató RID vezetőképességi CD fényszórásos LSD

23 Jó detektor kritériumai Széles koncentráció tartományban lineáris Érzékeny Szelektív (egymás melletti komponensek elválnak) Üzemeltetési költsége nem magas (lámpa)

24 UV-VIS, DAD A vegyületek UV energiát nyelnek el. Hullámhossza a vegyületben lévő konjugációk (Π kötések) mennyiségétől függ UV aktív csoportok Konjugált rendszerek, kromofór csoportok elnyelési maximumok: peptidkötés. 210 nm, aromás vegyületek 254 nm, triptofán 280 nm, kinonok 270 nm DAD spektrum 3D

25 DAD - 3D spektrum Abundance Idő (perc) Hullámhossz (nm)

26 Fluoreszcens detektorok Érzékenyebb Szelektívebb Csak fluoreszcenciával bíró komponensek detektálása Származékképzés (oszop előtt, oszlop után) Gerjesztés (excitáció), elnyelés (emisszió)

27 Elektrokémiai detektorok Elektroaktív csoportot tartalmazó komponensek Oxidálhatók Redukálhatók Munka-, segéd-, referencia elektród Aminok, aromás alkoholok, indolok, purinok Belső standard! Előny: nagyon érzékeny Hátrány: lassan áll be, elektródfelszín szennyeződik

28 Törésmutató detektor A komponens törésmutatója különbözik az eluensétől Csak izokratikus! Cukrok Hőmérsékletváltozásra érzékeny!

29 2D-HPLC

30 2D-HPLC

31 SMART készülék

32 Mikrodialízis mintavevő

33

34 Monoamin mérés agyi dializátumból

35 orotic acid cytosine cytidine uric acid damp 2'-deoxyuridine AU 2'-deoxycytidine thymine uridine xanthine thymidine inosine cgmp uracil hypoxanthine guanosine 2'-deoxyinosine 2'-deoxyguanosine 2'-deoxyadenosine adenosine camp Nukleozidok elválasztása hűtött C18 Hipersyl oszlopon 0,036 0,027 0,018 0,009 0, retention time (min)

36 AU uracil hypoxanthine cytidine uric acid deoxycytidine uridine xanthine deoxyuridine guanosine inosine thymidine adenosine deoxyadenosine Liquor, szöveti és mikrodialízis mintákból mért nukleozid szintek összehasonlítása 0,12 0,09 CSF 0,06 0,03 TISSUE 0,00 EXTRACELL min

37 Abundance Tripszines emésztés után BSA peptid fragmensek elválasztása Idő (perc)

38 Hol használjuk? Gyógyszeripar Hatóanyag-tartalom; Szennyezők és vagy bomlástermékek vizsgálata; Metabolizmus vizsgálatban Farmakokinetika Kombinatorikus kémia; stb.

39 Hol használjuk? Klinikai vizsgálatok Metabolikus rendellenességek vizsgálata; Tumormarkerek azonosítása; Neurotranszmitterek (acetilkolin, dopamin stb.); Élelmiszeripar Élelmiszer adalékok (vitaminok; E vegyületek; tartósítószerek; stb); Toxinok (aflatoxinok, ochratoxin, stb.) Aminosavak; Cukrok (fruktóz; glükóz; szacharóz stb.); Gyógyszermaradékok (Maximum Residue Level érték);

40 Hol használjuk? Környezet analitikában Poliaromás szénhidrogének; Peszticidek; Nem-ionos felületaktív anyagok; Stb. Bűnügyi vizsgálatok Kábítószerek (kokain, amfetaminok stb.); Dopping szerek (szteroidok); Robbanószer maradékok; Stb.