Alapösszef. és s azok lasztásrasra

Átírás

1 Alapösszef sszefüggések és s azok hatása az elválaszt lasztásrasra (A kromatográfia felosztása. Retenciós idő, reletív retenciós idő,visszatartási tényező, szelektivitás, elválasztási tényező, csúcsszimmetria, elméleti tányérszám) GC HPLC 1

2 A kromatográfiás módszerek csoportosítsa Történhet: I. az elválasztás helyzete, a résztvevő fázisok alakja és természete szerint II. az elválasztás alapját képező folyamat szerint III. a módszer kifejlesztése szerint IV. a mozgófázis halmazállapota szerint V. az elválasztandó anyag méretei alapján I. Csoportosítás az elválasztás helyzete, a résztvevő fázisok alakja és természete szerinti - nemcsak tiszta típusok léteznek, hanem átmeneti, vegyes típusok is, melyeket a fő folyamattal nevezünk el. Sorszám Módszer Fő folyamat Az anyag affinitása a fázishoz 1 adszorpciós adszorpció adszorpciós együttható kromatográfia 2 megoszlásos extraksió megoszlási állandó kromatográfia 3 ioncserés kromatográfia elektrosztatikus kölcsönhatás töltés, diszociációs állandó, ionátmérő 4 méretkizárásos kromatográfia diffúzió tényleges molekula méret 5 affinitás biospecifikus nincs általános mérték kromatográfia kölcsönhatások 6 királis kromatográfia sztérikus kölcsönhatás funkciós csoportok elhelyezkedése 2

3 1. Adszorpciós kromatográfia (folyadék-szilárd kromatográfia) A folyadékfázisban oldott anyagkeverék komponensei a szilárdfázis határfelületén különböző koncentrációban kötődnek meg - más a felülethez az affinitásuk. Felhasználása: 1903 (Cvet) oszlopkromatográfia (Kirchner és Stahlv) vékonyréteg kromatográfia gázkromatográfia as évektől folyadékkromatográfia részeként Alkalmazásai: - tájékoztató elővizsgálat - különböző számú funkciós csoportot tartalmazó vegyület elválasztása - alapmódszer az izomerek elválasztására gyógyszerszint mérések Feltétel: - az anyagok jól oldódjanak az adott szerves oldószerben - molekulatömegük közepes legyen (GC < > méretkizárásos kromatográfia) - nem lehetnek jelen ionos formában 3

4 Különböző adszorpciós technikák összehasonlítása hagyományos oszlopkromatográfia vékonyrétegkromatográfia nagynyomású folyadékkromatográfia (HPLC) 2. Megoszlási kromatográfia (folyadék-folyadék kromatográfia) Egymással nem, vagy csak részlegesen elegyedő folyadékokban az oldott anyag komponensei oldhatóságuknak vagy eltérő affinitásuknak megfelelően oszlanak meg. Az egyik folyadék fázist rögzítik az álló fázison, melynek felületén áramlik a másik, a mozgó fázis. 4

5 Kétfázisú oldószerrendszert használunk: az egyik fázis szerves oldószerben, a másik vízben gazdagabb (polárosabb). Ha: a.) a poláros fázist rögzítjük a hidrofil szilikagél vagy cellulóz hordozón és a mozgó fázis szerves oldószer, akkor NORMÁL fázisú kromatográfiáról beszélünk b.) amennyiben a hordozót telítjük szerves oldószerrel és a mozgó fázis poláros, akkor FORDÍTOTT fázisú kromatográfiáról van szó. Fő alkalmazási területe: fémkomplexek (pl.: B 12 és szintézisének kobaltkomplexei) szteroidok, kortizol, kortikosteroidok, 17- ketoszteroid kondenzált gyűrűs aromás vegyületek vitaminok aromás alkoholok, benzodiazepinek, drogok, alkaloidok stb, 5

6 3. Ioncserés kromatográfia Az álló fázis duzzasztott ioncserélő szemcse, melynek felületén kötött ionos csoportok vannak ( pl. -SO 3- ), melyekhez ellentétes töltésű ionok kapcsolódnak (pl.: X + ) és közöttük elektrosztatikus kölcsönhatás lép fel. A visszatartás alapja a mintakomponensek különböző ioncsere affinitása. Az ellenionok jelen vannak a mozgó fázisban is. Az ioncserélő az ellenionnal azonos töltésű ionokat tartja vissza (pl.: Y + ), mely kölcsönhatás függ az oldat ionerősségétől, a hidratált ionok tényleges nagyságától. A töltet lehet: a.) kationcserélő b.) anioncserélő 6

7 Az ioncsere mechanizmusa az ioncserélő aktjválása minta minta a minta megkötődése az ioncserélőn elúció eluens eluens minta minta Alkalmazás: elsősorban a biokémiában * aminosavak mérése fehérje hidrolizátumból * nukleotidok, nukleozidok, nukleinsavak * vitaminok (B 1,B 2, B 12,.) * gyógyszerek 7

8 4. Méretkizárásos kromatográfia (gélkromatográfia) rövidítése: SEC (Size Exclusion Chrom.) a molekulákat nagy pórusátmérőjű tölteteken méretük szerint választja el Meghatározó : - a molekula mérete mely arányos a tömegével - a molekulatartomány Dalton Feltétel: az állófázis felülete inaktív legyen semmilyen kölcsönhatás nem alakulhat ki az elválasztandó molekulákkal (hidrofób kölcsönhatás, adszorpció, ioncsere) az állófázis lehet: szilikagél, módosított szilikagél, szerves vagy szénhidrát polimer a töltet mérete: ált. 500 A o -nél nagyobb A méretkizárásos kromatográfia mechanizmusa A -aza molekulánál nagyobb méretűek mind kizáródnak B - a B és C komponensek méretüknek megfelelő időben hagyják el az oszlopot D C - a D és annál kisebb molekulák mindenhova beleférnek, azonos retencióval hagyják el a kolonnát 8

9 Alkalmazási területek: biopolimerek -(régebben lágy géleket használtak gél-szűrés, gélkromatográfia) peptidek enzimek elválasztása nagy molekulasúlyú szerves molekulák, polimer adalékok, lágyítók vizsgálata (régi elnevezés: gélpermeációs kromatográfia) 5. Affinitás kromatográfia Alapelv: speciális, szorpciós, deszorpciós folyamatokkal történik az elválasztás elsősorban biológiai és biokémiai folyamatokra jellemző kölcsönhatásokon alapul Pl.: - antigén - antitest - enzim - szubsztrát vagy inhibítor - hormon és receptora - stb... 9

10 6. Királis kromatográfia optikai izomerek (enantiomerek) elválasztása leggyakoribb alkalmazás: aminosavak és származékaik aromás aminok aromás szulfoxidok barbiturátok benzodiazepinek β-blokkolók kumarin származékok, stb... A ciklodextrin szerkezete ciklikus oligoszaharid felosztása: α(6)-, β(7)-, γ(8)-ciklodextrin 10

11 Metadon meghatározása plazmából II. Csoportosítás a kifejlesztő módszerek szerint 1./ Frontális kromatográfia az elválasztandó keverék oldatát a megszakításig folyamatosan adagoljuk nincs további mozgó fázis! preparatív célra nem alkalmas; analitikai jelentősége is kicsi 11

12 2. Kiszorításos kromatográfia az anyagkeveréket (A,B,C) egyszerre viszik fel az álló fázisra, majd a komponenseknél nagyobb affinitású, erősebben visszamaradó (D) vegyület oldatával folyamatosan mossák nincs teljes elválás, az anyagok részlegesen keverednek segédkiszorítókat alkalmazva jó preparatív eljárás 3. Elúció a.) folyamatos (izokratikus) elúció a vegyületek keverékét, alacsony polaritású oldószerben oldva (E), kis térfogatban viszik az álló fázisra és azt a továbbiakban egyenletesen, folyamatosan adagolják teljesen elvált zónák keletkeznek(a,b,c), közöttük tiszta oldószer (E) zónával akkor alkalmazható, ha az elválasztandó vegyületek és az álló fázishoz való affinitásuk nem nagyon különbözik egymástól 12

13 b.) lépcsőzetes elúció a komponensek elúciója az eltérő affinitások miatt elhúzódik, ezért célszerű az elúciót növekvő eluáló képességű oldószerekkel végezni probléma: sávasszimetria léphet fel egy vegyület két sávban eluálódik c.) gradiens elúció - Az álló fázisra belépő oldószer tulajdonsága változik jel - Az optimálás az erősebb (B) oldószer változtatásával történik Idő (perc) 13

14 III.Csoportosítás a mozgó fázis halmazállapota szerint GÁZ gáz - szilárd gáz - folyadék Gázkromatográfia (GC) Szuperkritikus fluid kromatográfia (SFC) -a mozgófázis kritikus hőmérséklete és nyomása fölötti, ún. fluid állapotú fázis FOLYADÉK folyadék -szilárd folyadék - folyadék Folyadékkromatográfia (HPLC) Megjegyzés: a gáz- és folyadékkromatográfiában az álló folyadékfázist szilárd hordozón rögzítik IV. Csoportosítás az elválasztott anyag mennyisége szerint 1.) analitikai: minőségi mennyiségi 2.) szemipreparatív - laboratóriumi kísérleti preparatív kromatográfia 3.) preparatív - kísérleti üzemi és ipari célú kromatográfia 14

15 V. csoportosítás az elválasztásban résztvevő fázisok alakja és természete szerint SIK elrendezésűek papír kromatográfia (1980-as évekre szinte elveszítette jelentőségét) vékonyréteg kromatográfia (VRK) túlnyomásos (nagyteljesítményű) vékonyréteg kromatográfia (OPLC) OSZLOP elrendezésűek gázkromatográfia (GC) folyadékkromatográfia (HPLC) kapillár elektroforézis (CE) Kromatográfiás módszereknél fellépő főbb kölcsönhatások adszorpció megoszlás ioncsere méretkizárás 15

16 Az elválsztás elméleti alapjai Az elválasztás során, a kromatogram kialakulása közben végbemenő folyamatok matematikai leírása bonyolult, ezért azokat teljességgel nem tárgyaljuk. Cél: * megismerni az elválasztás során azokat a főként fizikai folyamatokat, amelyek befolyásolják az elválaszthatóságot * az aktuális paraméterek ismeretében hogyan lehet az elválasztást szabályozni, optimalizálni a mintakomponensek az elválasztás során a heterogén összetételű álló- és mozgófázis között eltérő fizikai és kémiai tulajdonságaik következtében kölönbözőképpen oszlanak meg a kialakult rendszerre a minta és a fázisok dinamikus kölcsönhatása jellemző: MINTA ÁLLÓFÁZIS MOZGÓFÁZIS 16

17 a komponensek az állófázishoz való kötődésüknek megfelelően mozognak a mozgófázisban, melyet meghatároz: az álló- és mozgófázis összetétele, a hőmérséklet, a nyomás visszatartáskor a minta szétterül, létrehozza a zóna- vagy sávszélesedést, melynek oka elsősorban diffúzió, másrészt anyagátadási gátlás Örvénydiffúzió (Eddy diffúzió) A szemcseméret csökkentésével csökkenthető! Oka: a mozgófázis eltérő áramlási útja a széles csatornákban gyorsabban, a szűk, keskeny csatornákban lassabban halad az eluens a molekulák belekerülve ezekbe az áramlási csatornákba, hosszabbrövidebb szakaszt foglalnak el, ezáltal megnövelve a felviteli keskeny sávot 17

18 Anyagátadási gátlás a mozgó fázisban Oka: a mobilfázis az állófázis egyenetlen részei mentén eltérő áramlási sebességgel halad a szemcsék közelében az áramlási sebesség kicsi, vagy nulla, míg a csatorna közepén nagy Anyagátadási gátlás a mozgó fázis álló részében Oka: a szemcsék pórusaiban lévő mozgófázis nem mozog, hanem áll a meghatározandó molekulák diffúzió révén ki-be mozognak ezekben a pórusokban a sávszélesedés attól függ, hogy mennyi időt töltöttek a pórusokban 18

19 Anyagátadási gátlás az állófázisban Oka: a komponensek bediffundálva az állófázisba valamilyen mechanizmus révén be is hatolnak abba és ott megkötődnek ha a molekula mélyre hatol, akkor sokáig tartózkodik az állófázisban, ezzel megnövelve a sávszélesedést A kromatogram keletkezése 19

20 A kromatogram jellemzői 1.) a komponens retenciós ideje (t R ): a minta beadagolásától a csúcsmaximum megjelenéséig eltelt idő * értéke az adott rendszerre mindig állandó * felhasználható az ismeretlen komponens azonosítására 2.) a vissza nem tartott komponens retenciós ideje (t 0 ) A mintamennyiség hatása a retencióra kis mintamennyiségek estében a retenciós idő nem változik (a ) egy bizonyos kritikus értéknél a t R csökkenése figyelhető meg (b) a mintaméret további növekedésével a retenciós idő tovább csökken és gyorsan romlik az elválasztó képesség, a szelektivitás (c), (d). koncentráció)(mól/l) t 1 t 2 retenciós idő (perc) 20

21 A kapacitási tényező (k) és a mintatérfogat összefüggése Az ábrán látható összefüggés azt mutatja, hogy olyan mintaméret (μl) tartományon belül kell dolgozni, ahol a k értéke állandó k ez a kritikus érték a rendszer lineáris kapacitása, melyet túllépve a retenciós adat azonosításra nem használható Mintaméret (cm 3 ) 3.) visszatartási tényező (retenciós faktor; kromatográfiás megoszlási hányados; k) t R -t 0 megadja, hogy egy vizsgált k = komponens az elválasztás t 0 során mennyi időt tartózkodott az állófázison, viszonyítva a mozgófázisban töltött időhöz megfelő elválasztáskor k értéke gyakorlatilag 1-10 közé esik biológiai minták esetében k értéke 2-5 között megfelelő elválasztást jelent 21

22 k értékét térfogategységekben is megadhatjuk: V R -V 0 (nettó retenciós térfogat) k = V 0 (hottérfogat) következmény: a.) változtatjuk a hordozón az állófázis relatív mennyiségét, akkor megváltozik minden komponens k értéke is b.) változtatva a mobilfázis összetételét ugyancsak változnak a k értékek 4.) Szelektivitási tényező (α) : a két visszatartási tényező hányadosaként adható meg k 2 α = k 1 változtatása alapvetően két úton lehetséges: az állófázis megváltoztatásával (ún. állófázis hatás) a mozgófázis változtatásával (ún. mozgófázis hatás) a kettő egymással szorosan összefügg: pl., ha megváltozik a mozgófázis összetétele, akkor változik az adszorpciós réteg összetétele, de egyúttal változik az anyagok megoszlása és így a szelektivitás 22

23 A kromatográfiás csúcs az összetevők anyageloszlását mutatja nem írhatók le Gauss görbével, torzultak, nem szimmetrikusak a csúcsok alakját befolyásolja: túlterhelés, nyomás, hőmérséklet nem megfelelően megválasztott álló- és mozgófázis A csúcsszélesedés fő okai: áramlási- nem egyensúlyi folyamatok jelenléte diffúziós folyamatok anyagátadási folyamatok Sávelhúzódás oldószer okozta Poisson-féle kémiai exponenciáli s v. normális a.) kémiai : - a minta és az álló-/mozgófázis nem összeillő - a leszálló ág nehezen vagy egyáltalán nem tér vissza az alapvonalra - új fázisrendszert kell választani! 23

24 b.)oldószer okozta sávelhúzódás a minta oldására használt oldószer nem azonos az eluenssel nagyobb mennyiségű anyag után kis csúcsot akarunk detektálni megoldás: kisebb mennyiségű minta injektálása c.) Poisson-féle sávelhúzódás gyenge minőségű állófázis esetében alakul ki igyekezzünk azokat mellőzni 24

25 d.) exponenciális vagy normális sávelhúzódás minden kromatográfiás rendszerben megtalálható, bár esetenként alig észlelhető jól tervezett rendszerekben hatása elhanyagolható a HPLC-ben kisebb a sávok elhúzódása, mint a GC-ben 5. Csúcsfelbontás vagy relatív elválasztás (R S ) : a két szomszédos sáv középpontja és az átlagos sávszélességük hányadosaként adható meg (t 2 -t 1 ) R S = 2 (W 1 +W 2 ) W-a sávok csúcsszélessége nagyobb R S értékek jobb, a kisebbek gyengébb elválasztást eredményeznek 25

26 Az R S értékét meghatározza: a.) a visszatartási tényező (k) b.) az elméleti tányérszám (N), mely a komponens retenciós ideje és a sávszélessége ismeretében számítható N=16 t R 2 W R az N a kromatográfiás rendszer hatásosságát fejezi ki értéke egy kromatogram különböző sávjaira közelítőleg azonos A két sáv közül ha az egyik lényegesen kisebb a másiknál, az átfedés nagyobb mértékűvé válik: 1/1 1/4 1/16 koncentráció arányok Rs=0,6 Rs=0,8 Rs=1,0 Rs=1,25 26

27 N arányos az elválasztó rendszer hosszával (növekedésével nő) N= L (az elválasztó rendszer hossza) H (HEPT= height equivalent to theoretical;az egységnyi hosszban lévő hatásosság mértéke) a felbontás a következőképpen adható meg: R s = 1/4 N * (α-1)/ α *k/(k+1) az első tag az elválasztásra jellemző kinetikai hatásokat (zónaszélesedés), a második az elválasztást megszabó termodinamikai hatásokat, a harmadik tag a komponensek visszatartását adja meg az előző egyenlet egyúttal az elválasztás alapegyenlete is: R s = 1/4 N * (α-1)/ α *k/(k+1) ahol N - elméleti tányérszám α -szelektivitási tényezö k - visszatartási tényezö /kapacitásarány/ az alapegyenletben szereplő tényezők definíciója és a javasolt értékek: N= 16(t R /W b ) α=k 2 /k 1 k=(t R -t 0 )/ t 0 ahol: t R =retenciós idő ahol: k 2 >k 1 ahol: t 0 az inert W b =az alapvonalon anyag retenciós mért csúcsszélesség ideje N>1000 α >1,05 1< k >10 ha α =1 nincs biológiai mintaesetén elválás 2< k >5 27

28 Összefoglaló A kromatográfiás elválasztás célja: hasonló fizikai-kémiai szerkezetű vegyületek elkülönítése, azonosítása és mennyiségi meghatározása A kromatografálhatóság kritériuma: az anyagok átalakulás nélkül oldatba vihetők Az elválasztás alapja: két hasonló fizikai-kémiai tulajdonsággal rendelkező komponens megoszlása az álló- és egy állandó mozgásban lévő mozgófázis között Eluciós módszer: a minta bevitele impulzusszerűen (dugószerűen) történik, a mozgó fázis folyamatosan áramlik az állófázis felett és szorpciója kisebb, mint a legkevésbé szorbeálódó mintakomponenssé 28