GÉNPOLIMORFIZMUS ÉS DIPEPTIDIL PEPTIDÁZ IV (DPP IV, CD26) VIZSGÁLATOK PRIMER BILIARIS CIRRHOSISBAN ÉS HEPATIKUS OSTEOPATHIABAN DOKTORI ÉRTEKEZÉS

Átírás

1 GÉNPOLIMORFIZMUS ÉS DIPEPTIDIL PEPTIDÁZ IV (DPP IV, CD26) VIZSGÁLATOK PRIMER BILIARIS CIRRHOSISBAN ÉS HEPATIKUS OSTEOPATHIABAN DOKTORI ÉRTEKEZÉS DR. LAKATOS PÉTER Témavezető: Dr. Szalay Ferenc SEMMELWEIS EGYETEM Általános Orvostudományi Kar I.sz. Belgyógyászati Klinika 2001, Budapest

2 Tartalomjegyzék 1. ÖSSZEFOGLALÁS SUMMARY RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE BEVEZETÉS CÉLKITŰZÉSEK IRODALMI ÁTTEKINTÉS Primer biliaris cirrhosis Epidemiológia A primer biliaris cirrhosis patogenezise A klinikai kép, laboratóriumi eltérések és társuló betegségek A primer biliaris cirrhosis terápiája Hepatikus osteopathia primer biliaris cirrhosisban MÓDSZEREK Genetikai vizsgáló eljárások (polimorfizmus vizsgálatok) D vitamin receptor gén BSM I Ösztrogén receptor alfa gén Xba I illetve Pvu II Interleukin 1-receptor antagonista gén Osteodenzitometriai módszerek Vizelet keresztkötés meghatározás (piridinolin/kreatinin, deoxipiridinolin/kreatinin) Plazma endothelin-1 meghatározás Dipeptidil peptidáz IV (DPP IV) meghatározás AMA, D vitamin meghatározás és rutin laboratóriumi vizsgálatok EREDMÉNYEK Hepatikus osteopathia vizsgálata PBC-ben Genetikai tényezők szerepe az osteoporosis kialakulásában, kapcsolatuk az alapbetegséggel (polimorfizmus vizsgálatok primer biliaris cirrhosisban: D vitamin receptor gén BSM I, ösztrogén receptor alfa gén Xba I és Pvu II, interleukin-1- receptor antagonista gén)

3 A hepatikus osteopathia természetes lefolyása (A csont ásványianyag-tartalom utánkövetéses vizsgálata Ca és D-vitamin szupplementációban részesülő postmenopausás PBC-s betegekben) Plazma endothelin-1 vizsgálata PBC-ben A hepatikus osteopathia természetes lefolyása, patomechanizmusa, genetikai rizikótényezők. Diszkusszió DPP IV: szerepe a gyulladásban és fibrózisban. Indikátor, prognosztikus marker? DPP IV aktivitás PBC-ben DPP IV aktivitás krónikus C hepatitisben, a responder status szerepe DPP IV aktivitás kísérletes májcirrhosisban A DPP IV aktivitás és a májbetegségek lehetséges kapcsolata. Diszkusszió FŐBB ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK MELLÉKLET KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS IRODALOMJEGYZÉK Saját publikációk jegyzéke Felhasznált irodalom

4 1. Összefoglalás Kutatócsoportunk a krónikus májbetegségek patogenezisével, szövődményeivel és kezelési lehetőségeivel foglalkozik. A krónikus májbetegségek, így a primer biliaris cirrhosis (PBC), gyakori szövődménye a hepatikus osteopathia. Magas morbiditással és mortalitással jár. Az osteoporosis (OP) kialakulásában egyre fontosabbnak tűnik genetikai tényezők szerepe. Vizsgálni kívántuk ezért, hogy a PBC-ben megfigyelhető OP összefüggésbe hozható-e genetikai tényezőkkel. PCR módszerrel vizsgáltuk az postmenopausás OP kialakulásában fontosnak tartott D vitamin receptor (VDR) gén Bsm I, interleukin-1 receptor antagonista gén (IL-1RN) VNTR és ösztrogén receptor alfa (ER-α) gén XbaI, PvuII polimorfizmusokat PBC-ben. Megvizsgáltuk, hogy kapcsolatba hozhatók-e az OP megjelenésével, illetve az alapbetegséggel. Vizsgáltuk az OP gyakoriságát, természetes lefolyását Ca és D vitamin szupplementációban részesülő magyar PBC-s nőbetegekben. Tanulmányoztuk továbbá, hogy az in vitro az osteoblastok proliferációját fokozó és az osteoclastok aktivitását gátló endothelin-1 (ET- 1) szint változik-e PBC-ben, illetve hogy kimutatható-e összefüggés a plazma ET-1 szint és a csont-ásványianyag tartalom (BMD) között. Összefoglalva, az OP előfordulása postmenopausás PBC-s nőbetegekben, a nemzetközi adatokhoz hasonlóan gyakori volt (40-50%). Az irodalomban ellentmondó adatok voltak ismertek a VDR génről PBC-ben. Mi gyakoribbnak találtuk a magyar betegekben a BsmI BB genotípust és B allélt. Elsőként számoltunk be arról, hogy az ER-a XbaI Xx és a PvuII Pp genotípusok gyakoribbak PBC-ben, míg a betegek IL-1RN VNTR polimorfizmusa a magyar betegekben nem különbözött a kontroll csoporttól. Nem találtunk kapcsolatot a vizsgált polimorfizmusok és BMD között, így nem valószínű, hogy legalábbis a magyar PBC-s betegekben, ezeknek a polimorfizmusoknak jelentős szerepe van az OP kialakulásában PBC-ben. Vizsgálataink és az irodalmi adatok alapján felmerül annak a lehetősége, hogy az ER-α PvuII, XbaI és a VDR BsmI polimorfizmusoknak, esetleg kapcsolt géneknek szerepe lehet a PBC patogenezisében. Vizsgálataink szerint az OP kialakulásában a fokozott csontresorptiónak jelentős szerepe van. A munka másik részében egy a T-sejt aktivációban, és a cytokinek hasításában is fontos szerin exopeptidáz, a dipeptidil peptidáz IV (DPP IV) szerepét vizsgáltuk különböző etiológiájú májbetegségekben. Mivel a legnagyobb mennyiségben az epeutak expresszálnak DPP IV-et, és a PBC a kis epeutak sérülésével jár, vizsgálni kívántuk a szérum DPP IV aktivitást PBC-ben. Vizsgáltuk továbbá az aktivitást kezelt és 4

5 kezeletlen krónikus C hepatitises (CHC) betegekben és kísérletes cirrhosis modellben. Megvizsgáltuk, hogy kapcsolatba hozható-e a betegség progressziójával, a cirrhosis kialakulásával. Eredményeink azt mutatták, hogy különböző etiológiájú krónikus májbetegségekben (PBC, CHC), illetve kísérletes májcirrhosisban a DPP IV aktivitás cholastasis nélkül is emelkedett. Az emelkedés kapcsolatot mutat a nekroinflammatórikus enzimekkel (ASAT, ALAT), úgy tűnik, hogy indikátora a májkárosodás súlyosságának. 5

6 2. Summary Our Hepatology Research Team at the 1 st Department of Medicine of Semmelweis University is especially interested in the pathogenesis, complications and treatment of chronic liver diseases. Hepatic osteopathy is a common complication in chronic liver diseases, particularly in primary biliary cirrhosis (PBC). Genetic factors have been implicated in the pathogenesis of OP. Vitamin D receptor (VDR) gene, estrogen receptoralpha (ER-α) gene, and IL-1-receptor-antagonist gene (IL-1RN) are all attractive candidates for osteoporosis susceptibility. Therefore, we investigated the polymorphisms of the above genes in Hungarian PBC patients. Furthermore we aimed to study the natural history of metabolic bone disease, and the incidence of osteoporosis (OP) in Ca and vitamin D supplemented Hungarian female PBC patients. Since endothelin-1 (ET-1) has been found to stimulate osteoblasts and inhibit osteoclasts, in vitro, we also investigated the plasma ET-1 activity in PBC. OP was present in % of the patients. There is conflicting data on VDR in PBC. We found an overrepresentation of the BB genotype and B allele in Hungarian PBC patients. This is the first study to our knowledge to report on the ER-α XbaI and PvuII polymorphisms in PBC patients. An overrepresentation of the ER-α Pp and Xx genotypes were found in Hungarian PBC patients, while there was no difference in the IL-1RN VNTR polymorphism between PBC patients and controls. As none of the polymorphisms was associated with BMD, it is unlikely that these polymorphisms are essential in the prediction of lover BMD in PBC, at least not in Hungarian patients. Further studies are needed to determine whether ER-α PvuII, XbaI, VDR BsmI or linked polymorphisms might be involved in the pathogenesis of PBC. According to our results bone resorption plays an important role in the pathogenesis of OP in PBC. In the other part of our work we examined the serum dipeptidyl peptidase IV (DPP IV) activity in various chronic liver diseases. DPP IV is a cell surface serine exopeptidase, thought to be important in T-cell activation and in the cleavage of cytokines. It is mainly expressed on brush border membranes e.g. bile canaliculi, and the destruction of small bile ducts is characteristic for PBC. For that we sought to study serum DPP IV activity in PBC. We also measured the activity in chronic hepatitis C (CHC) and in experimental liver cirrhosis and investigated whether the activity reflects the severity of the disease. In conclusion serum DPP IV activity was elevated in PBC, CHC and in experimental cirrhosis even without the presence of cholestasis. A correlation was found between the DPP IV activity and the necro-inflammatory enzymes (ASAT, ALAT), and it seems to be an indicator for chronic liver injury. 6

7 3. Rövidítések jegyzéke ALAT alanin-aminotranszferáz ALP alkalikus foszfatáz AMA anti-mitokondriális antitest ANA anti-nukleáris antitest ASAT aszpartát-aminotranszferáz BCOADC branched chain 2-oxosav-dehidrogenáz komplex BMC bone mineral content, csont tartalom BMD bone mineral density, csont sűrűség D-pyr/c deoxipiridinolin/kreatinin hányados DPP IV dipeptidil peptidáz IV ECM extracelluláris matrix ER-α ösztrogén receptor alfa ET-1 endothelin-1 FAP fibroblast aktivációs protein FN bal femur nyak GGT gamma-glutamil-transzferáz GVH graft versus host HSC hepatic stellate cell, stellata sejt IFN interferon IL interleukin IL-1Ra interleukin-1 receptor antagonista protein IL-1RN interleukin-1 receptor antagonista gén L2-4 lumbalis gerinc OGDC 2-oxoglutarát komplex OLT orthotopic liver transplantation OP osteoporosis PBC primer biliaris cirrhosis PCR polymerase chain reaction PDC piruvát-dehidrogenáz komplex pyr/c piridinolin/kreatinin hányados RANTES regulated on activation, normal T cell expressed and secreted SD standard deviáció 7

8 SEM standard hiba, standard deviáció és az esetszám négyzetgyökének hányadosa TCR T-sejt receptor Th T-helper TNF tumor nekrózis faktor UDCA ursodeoxikolsav VDR D vitamin receptor VNTR variable number tandem repeat 1,25- (OH) 2 -D 3 1,25 dihidroxi D 3 vitamin 25-OH D vitamin 25 hidroxi D 3 vitamin 8

9 4. Bevezetés A krónikus májbetegségek okozta halálozás világszerte komoly népegészségügyi problémát jelent. Különösen igaz ez Magyarországon, ahol elsősorban az alkoholfogyasztási szokások miatt a májcirrhosis évente egyén haláláért tehető felelőssé. A cirrhosisos betegek száma ezt messze meghaladja. Kiemelten fontos ezért, hogy a krónikus májbetegségek patogenezisét, a kórlefolyást, a megelőzés és a kezelés lehetőségeit minél jobban megismerjük. A primer biliaris cirrhosis (PBC) ismeretlen eredetű, progresszív, cholestasissal járó májbetegség, mely az évek során cirrhosishoz, májelégtelenséghez vezet. A PBC a krónikus májbetegségek modelljének tekinthető. A betegség kialakulásában és a progresszióban szerepet játszó tényezők megismerése és tanulmányozása segítséget jelenthet a cirrhosis patogenezisének, és a különböző etiológiájú krónikus májbetegségek kialakulásának és progressziójának pontosabb megértésében, és új terápiás támadáspontok kialakításában. A hepatikus osteopathia, ezen belül az osteoporosis kialakulása ismert szövődmény. A gyakoribb csonttörés miatt fokozott morbiditással és mortalitással jár, a kérdés anyagi vonzata sem elhanyagolható. A folyamat patogenezisét, a prevenció és a kezelés lehetőségeit kutató vizsgálatok ezért nagy gyakorlati jelentőséggel bírnak. 9

10 5. Célkitűzések Kutatócsoportunk a Semmelweis Egyetem I.sz. Belgyógyászati Klinikáján a krónikus májbetegségek patogenezisével, szövődményeivel és kezelési lehetőségeivel foglalkozik. Kiemelt érdeklődési területeink közé tartozik többek között a primer biliaris cirrhosis, krónikus C hepatitis és a hepatikus osteopathia patogenezise, a kezelés lehetőségeinek kutatása. A krónikus májbetegségek gyakori, jelentős morbiditással járó szövődménye a hepatikus osteopathia. Az utóbbi években az osteoporosis kialakulásában egyre fontosabbnak tűnik genetikai tényezők szerepe. Munkánkban ezért célul tűztük ki a PBC és a PBC-hez társuló hepatikus osteopathia genetikai hátterének pontosabb feltérképezését. Az irodalomban ellentmondó adatok ismertek a D vitamin receptor (VDR) gén szerepéről a PBC-ben megfigyelhető osteoporosis kialakulásában. Ezenkívül vizsgáltuk a postmenopausás osteoporosis kialakulásában szerepet játszó interleukin-1 receptor antagonista gén (IL-1RN) VNTR és ösztrogén receptor alfa (ER-α) gén XbaI, PvuII polimorfizmusok eloszlását magyar PBC-s nőbetegekben. Választ kerestünk arra a kérdésre, hogy a vizsgált polimorfizmusok kapcsolatba hozhatók-e a hepatikus osteoporosis megjelenésével, illetve az alapbetegséggel. Célul tűztük ki a hepatikus osteopathia természetes lefolyásának, progressziójának vizsgálatát kalcium és D vitamin szupplementációban részesülő PBC-s nőbetegekben normális szérum kalcium és 25-OH-D 3 szint mellett. Vizsgáltuk továbbá, hogy az osteoblastok proliferációját fokozó és az osteoclastok aktivitását gátló endothelin-1 (ET-1) szint változik-e krónikus májbetegekben, illetve hogy az ET-1 szint és a csontok ásványianyag-tartalma között van-e jelentős összefüggés. 10

11 A dipeptidil peptidáz IV (DPP IV) egy szerin exopeptidáz. A molekula korábbi vizsgálatok alapján fontos szerepet játszik a cytokinek hasításában, a T-sejtek aktivációjában és a fibrózisban. Aberráns DPP IV expressziót írtak le humán hepatocellularis carcinomaban és máj cirrhosisban, de nem volt adat a DPP IV szerepéről egyéb májbetegségekben. PBC-ben jellegzetes a kis epeutak destrukciója. Mivel az epeutak nagy mennyiségben expresszálnak DPP IV-et, feltételezhető, hogy ebben a betegségben változik a szérum DPP IV aktivitás. Munkánkban ezért célul tűztük ki, hogy megvizsgáljuk a DPP IV aktivitást PBC-ben. Megvizsgáltuk, hogy kapcsolatba hozható-e a betegség progressziójával, segítséget jelenthet-e a betegség stádiumának pontosabb megállapításában. Állatkísérletes cirrhosis modellben vizsgálni kívántuk, hogy a DPP IV aktivitás kapcsolatba hozható-e a cirrhosis megjelenésével, a folyamat progressziójával. A krónikus C hepatitis szintén a máj károsodásával járó folyamat, világszerte komoly népegészségügyi probléma. Ezért célul tűztük ki annak vizsgálatát, hogy a DPP IV aktivitás kapcsolatba hozható-e a krónikus C hepatitis fertőzéssel, illetve, hogy változik-e a DPP IV aktivitás interferon terápia hatására. 11

12 6. Irodalmi áttekintés 6.1. Primer biliaris cirrhosis A primer biliaris cirrhosis (PBC) egy krónikus, ismeretlen eredetű, progresszív, cholestasissal járó májbetegség, mely az évek során cirrhosishoz, májelégtelenséghez vezet. Az élet fenntartásának egyetlen esélye ilyenkor egészséges máj transzplantációja. Az esetek döntő többségében az érintettek középkorú nők (95 %-ban). A betegség első leírása Addison és Gull nevéhez fűződik 1. Hanot 1876-ban xanthomás betegeket vizsgálva a betegséget hypertophiás cirrhosis -nak nevezte el. A PBC elnevezés eredetileg a Dauphinee és Sinclair szerzőpárostól származik, majd az orvosi köztudatba az elnevezés Ahrens és mtsai es közlése után épült be és szilárdult meg. Bár a diagnózis nem könnyű, az utóbbi évtizedekben egyre gyakrabban kerül felismerésre. Köszönhető ez a könnyen hozzáférhető laboratóriumi vizsgálatoknak, beleértve a betegségre jellegzetesnek tartott anti-mitokondriális antitest (AMA) kimutatását. A tipikus beteg középkorú nő, fáradtságról, viszketésről panaszkodik. Ennek hiányában ismeretlen eredetű hepatomegália illetve emelkedett szérum alkalikus foszfatáz érték keltheti fel a betegség gyanúját. Az alkalikus foszfatáz (ALP), a γ- glutamil transzferáz (GGT) értékek az aminotranszferáz (ASAT, ALAT) értékeknél jobban megemelkednek (cholestasisra jellemző minta), AMA pozitivitás %-ban mutatható ki. Fontos differenciáldiagnosztikai feltétel az extrahepatikus cholestasis kizárása, az epeutak szabad átjárhatóságának bizonyítása (ultrahanggal, CT-vel, ERCP / MRCP-vel vagy percutan cholangio-pancreatographiaval). A diagnózis végső soron májbiopsziával állítható fel. Jellegzetes elváltozás a kis intrahepatikus epeutak destrukciója, a portális mező krónikus gyulladása, előrehaladott esetben a máj kötőszövetes átalakulása. A szövettani kép a diagnózis felállításán kívül alkalmas a betegség stádiumának megállapítására, a prognózis pontosabb becslését teszi lehetővé Epidemiológia A betegség icidenciája és prevalenciája nagy földrajzi variabilitást mutat. (1. táblázat). Pontos prevalencia nem határozható meg, átlagosan / millió lakosra 12

13 számíthatunk. Az incidenciára vonatkozó adatok is meglehetősen változatosak: 2-14 / millió lakos / év. Szerző Vizsgálat helye Időpont Incidencia Prevalencia Inoue és mtsai Japán ,4-4,2 20 Watson és mtsai Ausztrália ,1 Witt-Sullivan és mtsai Kanada ,26 22,39 Remmel és mtsai Észtország ,3 27 Erikson és mtsa Svédország ,7 92 Löfgren és mtsai Svédország Hamlyn és mtsai Anglia Myszor és mtsa Anglia Boberg és mtsai Norvégia ,2 146 Kim és mtsai USA táblázat A PBC incidenciája és prevalenciája a világ különböző országaiban lakosra vonatkoztatva 3,4 Leggyakrabban az észak-európai országokban (elsősorban Svédországban) valamint Angliában észlelték, ugyanakkor japán és ausztrál kutatók meglehetősen alacsony incidencia és prevalencia értékekről számoltak be. Az utóbbi években növekvő incidenciáról és prevalenciáról számolnak be A primer biliaris cirrhosis patogenezise Genetikai tényezők A betegség kialakulásában családvizsgálatok alapján felmerült genetikai faktorok predisponáló szerepe. Gyakoribb előfordulást figyeltek meg családtagokban. Megjelent a betegség testvérekben, gyermekekben. Egyes adatok szerint egy érintett személy esetén, 6 % eséllyel lehet számítani a betegség kialakulásra további családtagokban 5. A beteg hozzátartozóiban gyakrabban mutatható ki a T-sejt reguláció zavara, ugyanakkor az AMA előfordulása nem gyakori az egészséges családtagok között. A HLA rendszer kapcsolata a PBC-vel az eddigi vizsgálatok alapján nem tisztázott. A HLA II. osztályba tartozó antigének közül felvetették a HLA DR8 és HLA DR8-DQB1*0402, német kutatók a HLA DPB1*0301, valamint japán szerzők a HLA DRB1*0803 lehetséges kapcsolatát a betegséggel 67. A HLA III. osztályba tartozó 13

14 lokuszok közül a C4B2 és a C4A*QO fokozott előfordulását figyelték meg. Japán szerzők a HLA-DR8 pozitív PBC-s betegekben a piruvát-dehidrogenáz komplex elleni antitestek fokozott előfordulását figyelték meg, a HLA-DR8 negatív betegek csoportjával összehasonlítva 8. Az utóbbi években a technika robbanásszerű fejlődésének köszönhetően, genetikai ismereteink jelentősen bővültek. Számos, a funkciója alapján a betegség kialakulásában fontosnak tűnő gént vizsgáltak. Így kapcsolatot találtak a CTLA-4 gén 1. exon, a TNF-α *308,, az IL-1B polimorfizmusa és a betegség kialakulásának lehetősége között 9,10. A VDR BsmI génpolimorfizmusról ellentmondásos adatok ismertek, míg az apolipoprotein E epsilon4 allélja inkább a betegség prognózisával mutatott kapcsolatot A T-sejt aktiváció zavara A betegségben a humorális és a celluláris immunitás komplex zavara figyelhető meg. Humorális immunitás zavarára utal, hogy a betegek jelentős részénél emelkedett, fokozottan immunreaktív szérum IgM szint figyelhető meg 12. Egyes betegekben alacsony molekulasúlyú IgM monomer mutatható ki, képtelenek IgM pentamer szintetizálására. Nem történik meg a váltás IgM-ről IgG-re. A magas szérum IgM szint bizonyos esetekben immunkomplexként viselkedik, spontán aktiválja a klasszikus úton a C3 komplement faktort (C3b és C3c). Számos autoantitest mutatható ki PBC-s betegek véréből 13 : így antimitokondriális antitest (AMA), anti-nukleáris antitest (ANA), a nukleáris membránnal reagáló antitest (gp210), antithyreoidea antitest, thrombocyta-ellenes (GP Ib/IX és GP IIb/IIIa elleni) antitest, anti-ss-a antitest, calreticulin elleni antitest, sp100 (nukleáris dot) ellenes antitest. Kimutatható hiszton elleni, centromer elleni és a biliaris epitheliumban jelen lévő karboanhidráz II ellenes antitest is. Ez utóbbi gyakoribb asciteses betegekben 14. Az antitestek IgM, IgG vagy IgA típusúak lehetnek. Antimitokondriális antitestek a PBC-s betegek %-ában mutathatók ki (2.táblázat). Bizonyítékok vannak arra is, hogy AMA pozitívitást mutató tünetmentes egyének egy részében idővel PBC alakul ki 15. Jelenlétük azonban megfigyelhető más betegségekben is (3. táblázat). 14

15 Antitest/antigén rendszer Az antigén legnagyobb mennyiségben Antigénje Membránokkal való kapcsolata Klinikai jelentősége M2 Szív 2-oxo dehidrogenáz BM Diagnosztikus marker M4 Máj szulfit-oxidázhoz KM Prognosztikus marker kapcsolódik M8 Vese nem ismert KM/mikroszoma Prognosztikus marker M9 Máj glikogén foszforiláz KM/citoplasma Diagnosztikus marker, enyhébb megjelenésű PBC-vel jár együtt anti- M2 negatív betegekben 2.táblázat A különböző PBC-ben kimutatható antigén / antitest rendszerek jellemzői (BM - belső membrán, KM külső membrán) 16 Fertőző betegségek Gyógyszerindukálta betegségek Kollagén betegségek Antitest típusa Klinikum Antigénje anti-m1, szifilisz II. sikeres antibiotiukum terápiát Cardiolipin követően eltűnik (BMM) anti-m5, akut myocarditis (60%- az antitest titer csökkenése Sarcosine ban), dilatatív cardiomyopathia remissziót jelez, perzisztálása dehidrogenáz (30%-ban) krónikus folyamatot (BMM) anti-m3, venocuran indukálta pseudolupus anti-m6, iproniazid indukálta hepatitis anti-m5a, ANA + vagy kollagén betegségek anti-m5b, ANA + vagy kollagén betegségek gyógyszer elhagyására a titer csökken gyógyszer elhagyására a titer csökken 3. táblázat Anti-mitokondriális antitestek előfordulása más betegségekben (BMM-belső mitokondriális membrán, KMM- külső mitokondriális membrán) Nem ismert (KMM) Nem ismert (KMM) Nem ismert (BMM) Nem ismert (KMM) Az esetek mintegy 5 %-ában AMA nem mutatható ki, ilyenkor viszont majdnem mindig jelen van valamilyen anti-nukleáris antitest (ANA). Az ilyen esetek mintegy felében karboanhidráz II ellenes antitest is kimutatható 14. Megváltozik a különböző cytokinek produkciója is 17. A megfigyelések szerint az IL-10, IFN-γ, IL-2, IL-4 expressziója csökken, ezzel ellentétesen az IL-5, IL-6 szintje emelkedik PBC-ben 18. A PBC stádiumainak előrehaladásával egyes interleukinok (IL-2, IL-4, IL-8, IFN, TNF) expressziójának fokozódását tapasztalták, míg egy másik autoimmun betegségben, primer szklerotizáló cholangitisben (PSC) éppen fordítva, a stádiumok előrehaladásával ezen IL-ek szintje csökkent (alkoholos májbetegségben az IL-8 szintjének emelkedését tapasztalták). 15

16 Celluláris immunfolyamatok zavarára utal, hogy a perifériás T sejtek számának csökkenését lehetett kimutatni 19. A sejtszám csökkenésének valószínű oka a T sejteknek a portális mezőbe való kiáramlása. Ugyanakkor a γ/δ T sejtek számának emelkedését mutatták ki mind a perifériás vérben, mind - ami még érdekesebb - PBC-s betegek májszövetének portális tereiben 20. A betegség korai stádiumában sem az MHC I és II molekulák, sem a T-sejtek aktivációjához szükséges kostimuláló BB1/B7 megjelenése nem mutatható ki, a specifikus T-sejtek aktivációja elmarad. Lehetséges tehát, hogy a korai stádiumokban éppen ezeknek a γ/δ sejteknek van döntő szerepe a kis epeutak destrukciójában. A CD4+ naiv T sejtek számának csökkenését lehetett kimutatni. A perifériás vérben a T-helper1 (Th1) és T-helper2 (Th2) limfociták eloszlása azonos. Érdekes lehet, hogy Harada és mtsai. PBC-s betegek májszövetében, in situ mrns hibridizációs vizsgálattal a Th1-re jellemző cytokin profilt mutattak ki 21. Megfigyelhető a perifériális T sejtek diszfunkciója is. A sejtek gyengén reagálnak IL-2-re, mitogén stimulációra szintén gyenge a válasz, csökkent mennyiségben szekretálnak limfotoxinokat, TNF-t, INF-γ-t. Ugyanakkor mind a perifériás, mind a májból származó T sejtek piruvát-dehidrogenáz komplex E2 és X alegységei hatására aktiválódnak, de aktiválódás mutatható ki más epeúti epithelialissejt antigén hatására is (pl. a B1 biliaris antigén) A PBC patogenezise Az eddigi nagyszámú vizsgálat ellenére a PBC patogenezise lényegében nem ismert. Az elképzelések szerint: 1, Virális, bakteriális vagy mesterséges faktorok kiváltó (trigger) hatására indulnak be az immunfolyamatok. Molekuláris mimikri útján az immunsejtek keresztreakciót adnak saját fehérjékkel. A második lépésben immár a triggertől függetlenül a fokozódó autoimmunitás okozza a betegség kialakulását és progresszióját. 2, Más elképzelés szerint a biliaris epithelium megváltozott antigén expressziója az elsődleges. Itt elsősorban a PDC-E2 korai, fokozott kifejeződését kell megemlítenünk. 3, Felmerült a fetalis mikrochimerizmus lehetséges kóroki szerepe is. Az ilyen irányú vizsgálatok eredményei azonban nem támogatják ezt a lehetőséget

17 Külön is említést érdemel a legfőbb mitokondriális antigén, a piruvátdehidrogenáz komplex (PDC). Számos vizsgálat bizonyította, hogy a PDC, mely azonos az M2 antigénnel, jelentős szerepet játszhat a PBC patogenezisében. A komplex négy alegységből épül fel (öt különböző antimitokondriális antitesttel reagáló epitop), melyek a megfelelő M2 antitesttípussal lépnek reakcióba. A fő antigének a PDC-E2, a PDC-E3BP, a branched chain 2-oxosav-dehidrogenáz komplex-e2 (BCOADC-E2) és a 2-oxoglutarát komplex-e2 (OGDC-E2) alegységei. Már a PBC igen korai stádiumában ki lehet mutatni a PDC overexpresszióját a biliaris epithel sejteken, ami nem jár az adott sejtekben a mitokondriumok számának megnövekedésével 23. A PDC-E2 illetve E3BP (E3 binding protein, vagy protein X) overexpresszió független a beteg AMA státuszától: mind AMA pozitív mind AMA negatív betegben kimutatható. A feltételezések szerint az enzim mitokondriumba irányuló transzportja szenved hibát, ez vezet az akkumulációjához, aberráns expressziójához. külső lipoil belső lipoil E1/E3 kötő katalitikus/e2 kötő régió régió régió régió aminosav régiók SYPPHMQVLPALSPTMTMGTVQRWEKKVGEKLSEGDLLAEI ETD K ATI 1.ábra A PDC-E2 alegység szerkezete, a nyilak a T-sejtek számára esszenciális epitopot mutatják Kimutatták, hogy a PBC-s betegekből származó, T-sejt klónok a humán PDC- E2 azonos régióját ismerik fel, nevezetesen a belső aminosav (AS) régiót (ez egyébként csaknem egybeesik a B-sejtek által felismert régióval: AS)

18 Vannak adatok arra is, hogy a tolerancia eredetileg nem az E2 antigénnel szemben, hanem a PDC-E3BP-vel szemben szűnik meg 25. A T-sejt epitop kialakításáért végső soron a AS között megfigyelhető ExDK szekvenciát teszik felelőssé 26. Ezt támasztja alá, hogy a PDC-E AS-ra specifikus T-sejtek keresztreakciót mutatnak a PDC-E AS-val illetve az OGDC- E AS-val. Ezek a peptidek szintén tartalmazzák a fent említett szekvenciát. Egyetlen sejtklón sem adott keresztreakciót azonban azokkal a saját peptidekkel (glikogén-foszforiláz-β, HLA-DRα), melyek jelentős homológiát mutatnak a humán PDC-E AS régiójával, ugyanakkor ExDK szekvenciával nem rendelkeznek. A molekula különös jelentőségét az adja, hogy igen konzervatív. Az eukarióta sejtekből származó PDC-k jelentős homológiát mutatnak egymással, megteremtve ezzel a molekuláris mimikri elvi lehetőségét. Ismert, hogy autoimmun folyamat jöhet létre, amikor mikrobák ellen termelt antitestek illetve T-sejtek keresztreakciót adnak saját fehérjékkel. A molekuláris mimikri, mint lehetőség a PBC-vel kapcsolatban is felvetődött. PBC-s betegekből származó immunkompetens sejtek keresztreakciót mutattak az E. coli PDC-E2 régiójával, mely szintén rendelkeznek ezzel a bizonyos ExDK szekvenciával, bizonyítva ezzel a molekuláris mimikri lehetőségét a T-sejtek szintjén 24. A Mycobacterium (M.) gordonae és M. bovis-szal kapcsolatban a tanulmányok hasonló eredményre jutottak is 27. A M. bovis 65 kd-os heat shock proteinje szintén keresztreakciót adott az AMA-kal, sőt érdekes módon M. tuberculosisos betegekben is kimutatható volt PDC-E2 elleni antitestek termelése. Anti PDC-E2 antitestek a tünetmentes, egészséges populációban is kimutathatók. A tanulmányok szerint ugyanakkor, az ilyen egyének legalább is egy részében idővel PBC alakul ki 15. Irodalmi adatok szerint keresztreakció figyelhető meg az AMA-k és számos további mikroba között is (pl. Yersinia enterocolica, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus és Salmonella mirabilis) 27. A vizsgálatok szerint a PBC-s betegek széruma képes gátolni más fajokból származó PDC-t is. Leginkább az emlősökből származó PDC-t gátolja, közepesen hat a Saccharomyces cervisiae PDC-re, míg alig gátolja az E. coli PDC-t 28. Utóbbi megfigyelés az E. colival kapcsolatos molekuláris mimikri lehetősége ellen szól. Érdekes megfigyelés, hogy PBC-s betegek májszövetében majdnem az összes esetben sikerült Helicobacter spp. DNS-t kimutatni (főleg H. pylori-t, és nem az epére 18

19 rezisztens H. bilist vagy H. hepaticust), míg kontroll egyének májszövetében egyetlen esetben sem 29. Beszámoltak bizonyos retrovirális ágensek lehetséges szerepéről is 30. PBC-s betegek széruma fokozottan reagált a HIV p24 gag proteinnel, és a human intracisternal A-type particle (HIAP) endogén retrovírussal. Lehetséges persze molekuláris mimikri xenobiotikumokkal szemben is. Egy a közelmúltban megjelent publikációban in vitro PBC-s betegek széruma keresztreakciót adott halidált illetve metilhalidált peptidekkel 31. Korai stádiumban sem az MHC II, sem a kostimulátor BB1/B7 (B7-1, B7-2) molekulák expressziója nem fokozódik 32. A specifikus T-sejt így aktiváció elmarad. A PDC-E2 korai overexpressziója ugyanakkor jelen van 23. Egyes adatok szerint az IL-1 és az IFNγ fokozza a PDC-E2/E3BP expressziót és az MHC II kifejeződést biliaris epithel sejteken 33. Továbbá a portális terekben az antigén felismeréshez MHC jelenlétét nem igénylő γ/δ T sejtek számának megnövekedése, illetve a MUC1 apomucinra reagáló citotoxikus T sejtek (CD8+) jelenléte figyelhető meg 20. Ezeknek a sejteknek a kezdeti léziók kialakulásában jelentős szerepe lehet. A folyamat progressziójához nem specifikus módon már a kezdeti stádiumokban is hozzájárulhat a betegségben megfigyelt fokozott lipid peroxidáció, fokozott oxidatív stressz és a fokozott apoptózis 34,35. Érdekes, hogy in vitro cytokinek hatására MHC II kifejeződést mutató humán biliaris epithel sejtek képtelenek voltak CD4 pozitív T sejtek aktiválására 36. Az MHC II kifejeződés inkább a gyulladásos folyamat következményének látszik. Mindezek a megfigyelések arra utalnak, hogy legalábbis a betegség korai stádiumában (amíg nem jelennek meg az epithel sejtek felszínén a kostimulátor BB1/B7 molekulák) a biliaris epithelium nem játszik jelentős szerepet a T-sejtek specifikus aktiválásában. Nem tudjuk azonban, hogy létezik-e preimmunitás a mitokondriális antigénekkel szemben. Ebben a koncepcióban az anerg autoreaktív T-sejteket a dendritikus sejtek, vagy ami még valószínűbb, az alapvetően nem antigén prezentáló funkciójú B-sejtek aktiválnák. 19

20 B-sejt autoantitest T-sejt EPEÚTI SÉRÜLÉS inflammáció cytotoxicitkus hatás autoantigének Molekuláris mimikri MHC II endogén vs. exogén Antigén prezentáló sejt Környezet fertőző ágensek xenobiotikum 2. ábra A primer biliaris cirrhosis feltételezett patogenezise. A bakteriális, virális vagy mesterséges peptidek az immunrendszerrel kapcsolatba kerülve specifikus immunválaszt hoznak létre. Amennyiben az így bejutó antigének keresztreakciót mutatnak saját molekulákkal molekuláris mimikri jöhet létre. A tolerancia megszűntével a saját molekulák az immunrendszer számára antigénként szolgálhatnak, és immáron a trigger nélkül is fenntartják az immunreakciót. Az is lehet, hogy más fajokból származó, a humán fehérjékkel keresztreakciót adó antigének felismerése, majd a saját megfelelő epitopok idegenként való felismerése és így antigénként való prezentálása vezet az autoreaktív T sejtek aktiválódásához, a saját fehérjékkel szembeni tolerancia megszűnéséhez. Lehetséges, hogy a folyamatos bakteriális inzultusnak kitett, a bél lamina propria-jában található B1-sejtek (IgM termelő differenciálatlan B-sejtek) teszik meg az első lépést az autoimmun folyamat 20

21 elindításában 37. Ez megmagyarázná, hogy miért jelentkezik következetesen IgM szint emelkedés PBC-s betegekben, illetve azt is, hogy miért perzisztál a magas IgM szint májtranszplantáció után. Lehetséges persze, hogy ez utóbbi a nyirokcsomókban jelen lévő, a mitokondriális antigénre már érzékeny antigén-prezentáló sejtklónok működésének következménye. Megfigyelték továbbá, hogy a biliaris epithelsejtek és a májsejtek között elhelyezkedő tight junction-ok szerkezete megváltozik 38. Ez a paracelluláris permeabilitás megnövekedéséhez vezet, ami módot ad az epesavaknak és különböző antigéneknek az epeutak lumenéből a portális térbe való fokozott beáramlására, így befolyással lehet az immunfolyamatokra A klinikai kép, laboratóriumi eltérések és társuló betegségek A PBC jellegzetesen a éves korosztály megbetegedése, de beszámoltak 22 és 93 éves korban diagnosztizált esetekről is 39. A betegek több mint 90%-a nő, a női predominancia oka nem ismert. Gyakran tünetmentes állapotban kerül felismerésre: a betegek többsége elsőnek nem specifikus tünetekről számol be. Viszketés és gyengeség a leggyakrabban jelentkező tünet, gyengeségről a betegek 3 / 4-e viszketésről, a betegek több mint fele panaszkodik. Az aszimptomatikus betegek csoportjában megjelenő első tüneteket a 4. táblázat szemlélteti: % % Klinikai jellemzők Laboratóriumi eltérések Nők aránya AMA Gyengeség AMA + (>500) Pruritus ALP >2 x normál Hepatomegália Bilirubin >25 µm 5-20 Társult autoimmun megbetegedés Albumin <30 g/l 0-3 Splenomegália Hiperpigmentáció 8-20 Granulómák Xanthomák 2-8 Xanthalesmák táblázat Az egyes tünetek százalékos előfordulása PBC-s betegekben a diagnózis felállításakor A PBC-s betegekben megfigyelhető viszketés oka nem ismert. Felvetődött az epesavak retenciójának a szerepe. Nem bizonyítható összefüggés a szérum epesav szint 21

22 és a viszketés között, bár egy amerikai vizsgálatban összefüggést találtak a gyengeség és a pruritus szubjektív súlyossága, illetve az ASAT, az IgG, az ALP és a szérum bilirubin szintek között, ursodeoxikolsav terápia mellett. Gyakran megfigyelhetők excoriációk. A sárgaságtól függetlenül hiperpigmentáció, xanthomák, xanthalesmák lehetnek jelen. A lép és a máj tapinthatósága a betegség progressziójával párhuzamosan egyre gyakrabban figyelhető meg. Jelentkezhet szájszárazság, könnyelválasztási zavar. Beszámoltak a jobb felső hasi kvadráns területére lokalizált diszkomfort érzésről, és néha már az első észleléskor az előrehaladott betegség tüneteivel, mint oesophagus varicositás, hepaticus encephalopathia találjuk szembe magunkat. Irodalmi ritkaságként a késői stádiumban leírtak a réz akkumulációja miatt jelentkező Kayser-Fleischer gyűrűt is 40. Az akut cystitis és az aszimptomatikus bakteriuria is gyakrabban fordul elő PBC-s betegekben. A leggyakoribb laboratóriumi eltérés a máj eredetű ALP izoenzim szérumszintjének jelentős megemelkedése (lásd 4. táblázat). Az ALP -vel párhuzamosan a γgt és az 5 -nukleotidáz enzimek szérum szintjének emelkedése tapasztalható. A ASAT és a ALAT legtöbbször csak kis mértékben emelkedettek a betegség kezdetekor. A szérum bilirubin szintnek kitüntetett szerepe van, a primer biliaris cirrhosis prognózisát becslő modellek alappillére (Mayo modell) 41. A szérum lipidek igen jelentős emelkedése figyelhető meg. A szérum cholesterin akár az 1000 mg/dl-es szintet is meghaladhatja, főleg a xanthomás betegekben. A kezdeti stádiumban a VLDL és LDL emelkedését messze felülmúlja a HDL szint megemelkedése, ez lehet a magyarázata, hogy a magas szérum cholesterin szint ellenére sem az arteriosclerosis, sem az ebből eredő halálozás nem gyakoribb PBC-ben. Hozzájárul ehhez a koronária-betegségre rizikófaktort jelentő lipoprotein a (Lp a) szérumszintjének a betegségben megfigyelhető csökkenése is. A betegség előrehaladott stádiumában az LDL-koleszterin szint jelentős emelkedése és a HDLkoleszterin szint jelentős csökkenése figyelhető meg, illetve megjelenik egy abnormális, a cholestasisra jellemző lipidfrakció, a lipoprotein-x (LP-X) is. Az IgM szint rendszerint magas, nem specifikus eltérés, de jelenléte támogatja a PBC diagnózisát. Beszámoltak a PBC-vel kapcsolatban IgA deficienciáról is. 22

23 Eltérés lehet a szérum epesavak, a coeruloplasmin, a réz, az α2-makroglobulin, az α1-antitripszin és a cink szérum szintjében, és elsősorban a cirrhosissal összefüggésben az albumin csökken. Szövődmények A kórlefolyást az alapbetegség progressziója, a krónikus intrahepatikus cholestasis következtében kialakult jelenségek és a máj parenchymalis elégtelenségének kialakulási üteme együtt határozzák meg. A késői szövődmények nem specifikusak a PBC-re, tulajdonképpen a cirrhosis, a májelégtelenség tüneteivel kell számolnunk. A portális hipertenzió hamarabb jelentkezik, már a szövettanilag igazolt cirrhotikus stádium megjelenése előtt gyakori. A stádiumok előrehaladtával fokozódik a cholestasis. A lép és gyakrabban a máj a betegség progressziójával párhuzamosan egyre gyakrabban tapintható. Megfigyelhető az icterusos betegekben gyakori steatorrhoea. Ehhez a zsírban oldódó vitaminok malabszorpciója társul, ez azonban csak ritkán ér el olyan fokot, hogy A, K vagy E vitaminok orális bevitele indokolt lenne. Gyakori, bár az UDCA kezelés általánossá válása óta egyre ritkább az osteoporosis kialakulása. Előrehaladott stádiumokban gyakori az oesophagus varicositas és a varixvérzés. Jelentkezhet ascites, hepatikus encephalopathia és a hypalbuminaemiaval összefüggésben oedema. Terminálisan gyakori a súlyos bakteriális általában Gram negatív fertőzés. Társult betegségek A PBC számos autoimmun kórképpel társulhat. Az u.n sicca szindróma 42 elemei a betegek felében, háromnegyedében kimutathatók, a tünetek súlyossága, és gyakorisága a betegség lefolyása során nő. Nem ritka a keratoconjunctivitis. A leggyakoribb társult autoimmun betegség a Sjögren szindróma, amely akár a betegek %-ában jelen lehet 3. Gyakori a Hashimoto thyroiditis is (5-20 %), a betegek közel 1/3-ában thyreoglobulin ellenes antitest mutatható ki. SLE, rheumatoid arthritis társulását az esetek 3-6 %-ában észlelték 3. Scleroderma, Raynaud szindróma a betegek 1-4%-ban lehet jelen. Előfordulhat IgM asszociált membranosus glomerulonephritis, fokális glomerulonephritis és renális tubuláris acidosis is. Leírták 23

24 anaemia perniciosa, hemolitikus anaemia, autoimmun thrombocytopenia, coeliakia, colitis ulcerosa, polymyositis, dermatitis herpetiformis, valamint a sarcoidosistól nehezen elkülöníthető interstitiális fibrosis társulását is 43,44,45, A primer biliaris cirrhosis terápiája A széleskörű kutatások és klinikai próbálkozások ellenére nem rendelkezünk megfelelő oki kezeléssel, egyetlen eddig ismert gyógyszer sem képes önmagában a betegség gyógyítására 47. A terápiás próbálkozásokat három csoportba oszthatjuk: (1) a betegség specifikus, oki terápiája, (2) preventív terápia és (3) tüneti kezelés. Végső megoldásként -és ez az eddig ismert egyetlen gyógymód, ami a beteg tényleges gyógyulásához vezet- a májtranszplantációt kell megemlítenünk. Lényeges előrelépés, hogy az újabb közlemények alapján a kezelt betegek várható életkilátásai alig rosszabbak az átlagpopulációhoz képest 48. Specifikus, oki terápia A betegség kiváltó oka pontosan nem ismert, így a szó szorosan vett értelmében oki terápiáról nem beszélhetünk. A primer biliaris cirrhosis kezelésében új korszakot nyitott az ursodeoxikolsav (UDCA) kezelés bevezetése. Nagy multicentrikus nemzetközi tanulmányok alapján az UDCA kezelés nemcsak a specifikus laboratóriumi eltéréseket és az életminőséget javítja, hanem a gyulladásos folyamatra illetve a szövettani eltérésekre is kedvező hatással van, lassítja a betegség lefolyását és megnöveli a transzplantációra való alkalmasság idejét is 49. A napi dózisa mg / tskg. Az UDCA choloretikus epesav, terápiás hatása nemcsak az intrahepatikus epesavak transzportjának és biliaris kiválasztásának a fokozásának köszönhető, hanem ami talán még jelentősebb az UDCA helyettesíti a májra sokkal toxikusabb hidrofób epesavakat, így csökkenti a pangó epe hepatotoxicitását 50. Májsejteken direkt membránstabilizáló hatását is megfigyelték. Egyes adatok szerint immunmoduláns, antiapoptotikus hatása is van 51. Kísérletesen csökkenti a lipid peroxidációt és a heat-shock protein expressziót PBC-s betegekben 52,53. Próbálkoztak egy hidrofilebb epesavval, a tauro-ursodeoxikolsavval is. Az előzetes eredmények szerint hatékonyabb az UDCA-nál 51. Egy másik tanulmány a 24

25 még jobbnak találta a koleszterin és foszfolipid szekréció stimulálása szempontjából a tauro-hiodeoxikolsavat, amellett hogy a molekula egyáltalán nem volt toxikus a májra 54. Az UDCA-ra nem vagy gyengén reagáló betegekben próbálkozások történtek különböző kombinált UDCA alapú kezelésekkel. Prednisolon terápia a májfunkciókat kedvezően befolyásolta 55. Alkalmazását mellékhatásai limitálják, az osteoporosist is súlyosbítja. UDCA-val kis dózisú kortikoszteroidot együtt adva kedvező eredményekről számoltak be. Biztatóbb eredményekről számolhatunk be a budesoniddal kapcsolatban, bár a tanulmányok eredményei egyelőre ellentmondóak 56. A colchicin és methotrexát terápia UDCA-val kombinálva hatástalan volt, vagy csupán minimális javulást eredményezett 57. Ugyanígy eredménytelen volt a cyclosporin-a, azathioprin, chlorambucil, D-penicillinamin és sylimarin terápia is. A közelmúltban egy kis esetszámú tanulmányban bezafibrát adása kedvezőnek bizonyult 58. A transzplantáció (OLT-orthotopic liver transplantation) jelentősége PBC-ben A jelenleg rendelkezésre álló egyetlen, a betegség tényleges gyógyulását jelentő terápiás beavatkozás a transzplantáció. Fontos kérdés a túlélés. Az elmúlt évtizedben jelentős fejlődés figyelhető meg. A módszer biztonságos, a túlélés lényegesen jobb, mint az a transzplantáció nélkül várható lenne. Az 1980-as évek végén az 1, és 5 éves túlélés 71 ill. 66 %-os volt, 2001-ben 83, 78 és 67 %-os 1, 5 és 10 éves túlélésről számolhattak be a kiforrottabb műtéti technikának és effektívebb gyógyszeres kezelésnek köszönhetően 59. Fontos kérdés, hogy visszatér-e a betegség a transzplantáció után. A kérdés megválaszolása nem könnyű, vannak adatok, amelyek a PBC-re specifikus eltérések és így a betegség visszatérése mellett szólnak, ugyanakkor tény, hogy a graft versus host (GVH) betegségben jelen lévő elváltozások nagyfokú hasonlóságot mutatnak a PBC-s léziókkal. Igencsak nehezen -néha egyáltalán nem- dönthető el teljes bizonyossággal, hogy adott esetben a rejekció részeként figyeljük-e meg a vanishing bile duct szindrómát, vagy a homológia miatt nagyon hasonló PBC visszatértével állunk-e szemben

26 Tüneti terápia A betegségben megfigyelhető pruritus oka nem ismert 61. Felvetették az epesavak oki szerepét, de az erre vonatkozó klinikai megfigyelések ellentmondásosak. Tény azonban, hogy a cholestyramin, egy epesav kötő gyanta volt az első gyógyszer, amely enyhített a betegek kínzó viszketésén. Felvetődött az endogén opioidok szerepe is, az opiátantagonista naloxon egyes adatok szerint hatásosnak tűnt a pruritus kezelésében. De történtek próbálkozások fenobarbitállal, flumecinollal és rifampicinnel is. Az UDCA is megfigyelték kedvező hatását a pruritusra. Próbálkoztak továbbá fototerápiával, illetve a késői stádiumokban, a nem reagáló esetekben plazmaferezissel. A PBC-s betegek által gyakran panaszolt tünet a fáradtság 61. Swain és Maric a cholestatikus patkányokon végzett kísérleteiben a corticotrop-releasing hormon szekréciójának csökkenését, és ezzel párhuzamosan az állatok viselkedésének a megváltozását észlelte 62. Így felvetődik, hogy a corticotrop-releasing hormon szekréciójának stimulációjával a betegek fáradékonysága enyhíthető lenne. Kísérletesen, cholestatikus állatokban a fáradtságot, az aktivitáscsökkenést szerotonin receptor antagonista adásával sikerült kivédeni 63. Lehetséges, hogy ezeknek a molekuláknak a jövőben a humán terápiában is szerepe lehet. 26

27 6.2. Hepatikus osteopathia primer biliaris cirrhosisban Irodalmi adatok szerint PBC-ban gyakori szövődmény az osteoporosis (OP), amely az életkortól függetlenül és a hiperbilirubinaemia klinikai jelei nélkül is kialakulhat 64. A hepatikus osteopathián eredetileg a kezeletlen betegekben megfigyelhető osteomalácia és OP együttesét értettük, azaz osteoporomaláciát. A PBC-ben megfigyelhető csont ásványianyag csökkenés a mai álláspontunk szerint nem osteomalácia, hanem OP. A korábban gyakorinak tartott osteomalácia az UDCA kezelés bevezetése óta ritkán mutatható ki 65. A különböző tanulmányokban a betegek %-ában diagnosztizáltak OP-t. Újabb felmérések szerint kb %-os előfordulást észleltek, valószínűleg a korai diagnózisnak és talán a kezelésnek is köszönhetően, kétségtelen ugyanakkor, hogy ezek a betegek fiatalabbak voltak 66,67. A PBC-ben kialakuló hepatogen OP patomechanizmusa pontos részleteit tekintve nem ismert. Krónikus májbetegségekben a csontok épségére számos tényező van kedvezőtlen hatással, mint például a hiányos táplálkozás, a malabszorpció, a hormonális tényezők megváltozása vagy az immobilizáció. Korábbi tanulmányok alapján felvetődött, hogy a cholestaticus körülmények miatt a bélből hiányzó epesavak, illetve az emiatt fennálló kalcium és D vitamin malabszorpció, és másodlagos hiperparathyreosis okozná a szkeletális rendszer elváltozásait,68,69. Az irodalomban a tanulmányok nagy részében a megfelelő kalcium és D-vitamin bevitel mellett normális szérum kalcium és D-vitamin szinteket találtak 70,71. Vizsgálták az osteocalcin szempontjából fontos K vitamin hiány lehetséges szerepét is, és megállapították, hogy sok betegben már a K vitamin hiány megjelenése előtt diagnosztizálható az OP. Megfigyelték a csont-remodelling megváltozását is. A vizsgálatok szerint precirrhotikus stádiumú betegekre elsősorban a csontépítés csökkenése, az alacsony csontturnover jellemző. A tanulmányok egy része a nem megfelelő osteoblast funkcióra helyezi a hangsúlyt 72. Mások a fokozott csontturnover 73,74 elsődlegességét hangoztatják. Ez fokozott csontképzéssel és resorpcióval jár. 27

28 A csökkent csontképzés szerepére utal, hogy munkacsoportunk egyik előző tanulmányában az osteoblast funkciót jelző osteocalcin szérumszintjét nem-alkoholos idült májbetegekben és PBC-s betegekben súlyos cholestasis esetén alacsonyabbnak találta 75. Egyre több adat utal arra, hogy a cytokinek befolyásolják a csontanyagcserét. A proinflammatorikus cytokinek közül az IL-1 β, a TNF-α és az IL-6 fokozzák az osteoclastok aktiválását és osztódását, ezúton az OP irányába hatnak 76,77. Ezzel összhangban van, hogy PBC-s betegekben emelkedett szérum IL-6 és TNF-α szintről számoltak be 78. Nem ismert azonban, hogy lokálisan milyen a cytokinek koncentrációja és hatása. A kérdés bonyolultságát mutatja, hogy OP-s betegekből és kontroll személyekből származó osteoblast sejtek in vitro cytokin produkciójában nem találtak különbséget 79. Még sok vizsgálat szükséges ahhoz, hogy a cytokinek szerepét pontosan tisztázni lehessen az OP kialakulásában. A májbetegség közvetett vagy közvetlen szerepére utal, hogy az OP gyakorisága a vizsgálatok szerint összefüggést mutat a betegség fennállásának idejével illetve a májbetegség stádiumával. In vitro vizsgálatokban a nem konjugált hiperbilirubinaemia gátolja az osteoblastok osztódását 80. A cholestasis súlyosságát mutató bilirubinnak az OP patogenezisében játszott szerepéről ellentmondó közlések ismertek 81,82. Egyes vizsgálatok szerint a májszövet károsodására utaló szérum transzamináz szintek és az OP kialakulásának valószínűsége között összefüggés van. Fontos kérdés, hogy a PBC-s betegekben előforduló OP mennyiben tartható az alapbetegség következményének és mennyiben lehet szó az idiopathias vagy menopausás OP-val való véletlenszerű együttes előfordulásról. További kérdés, hogy a májbetegség minden betegben vagy csak az OP-ra hajlamos betegekben fokozza-e a csontvesztés mértékét. Az OP kialakulásában egyre fontosabbnak tűnik örökletes, genetikai tényezők szerepe. A postmenopausás OP genetikai hátterének vizsgálata az utóbbi évek kutatásainak egyik slágertémája. Számtalan candidate gén lehetséges szerepét vizsgálták. PBC-ben eddig az OP-val kapcsolatban a D-vitamin receptor (VDR) és a 28

29 kollagén Iα1 gének szerepét vizsgálták. Egy amerikai tanulmányban a bat VDR haplotípus az OP kialakulásának veszélyét növelte 81. Ezt az eredményt azonban a későbbi tanulmányokban nem sikerült megerősíteni. Egy magyar tanulmányban a BB allél esetén tendenciaszerűen alacsonyabb csontdenzitásértékeket mértek, míg spanyol adatok szerint a VDR gén polimorfizmusa nem volt kapcsolatban az OP valószínűségével 82,83. Ez utóbbi vizsgálatban a kollagén Iα1 gén s allélje csökkent csont-ásványianyag tartalommal járt együtt. Az osteoporosis kezelése PBC-ben A PBC-ben bázisterápiának számít az ursodeoxikolsav kezelés. A gyógyszer nem csak a laboratóriumi adatokat és az életminőséget javítja, hanem lassítja a betegség progresszióját is 47. Közvetett módon az OP kialakulását is lassíthatja, erre utal, hogy az újabb vizsgálatokban PBC-ben az OP gyakorisága csökken. Az osteomalácia meggyógyítható, de az OP nem. A terápia és a prevenció alappillére a D-vitamin és a kalcium szérumszintjének monitorozása és a szükség szerinti pótlás 84. Újabb tanulmányok alapján aktív D vitamin metabolitok eredményesek voltak a post-transzplantációs OP terápiájában is. Calcitonin, illetve fluorid terápiának semmilyen kedvező hatása nem volt. Ösztrogének adása a mellékhatások (közöttük a cholestasis) miatt ellentmondásos, több vizsgálatban adásuk kedvező volt PBC-s betegekben 85. A hatásmechanizmus talán részben az IL-6 termelés gátlásán keresztül valósul meg, más elképzelések szerint fontosabb az osteoclastok IL-1-re adott válaszának gátlása 86. A mai ismereteink alapján a már kialakult OP kezelésében leginkább a biszfoszfonátok alkalmazhatók. Egy kétéves utánkövetéses vizsgálatban az etidronát hatásosnak bizonyult a további csontvesztés megelőzése szempontjából 87. Az alendronát a tanulmányok alapján még hatékonyabbnak tűnik 84. Sikerrel alkalmazták e szereket szteroid terápia mellett és transzplantáció után is. 29

30 7. Módszerek 7.1. Genetikai vizsgáló eljárások (polimorfizmus vizsgálatok) A DNS-t perifériás EDTA-val antikoagulált vérből DNS kit segítségével izoláltuk a gyártó által megadott módon (Promega, Wizard, Genomic DNA Purification Kit, Madison, WI, USA). Az összes PCR reakcióhoz Hybaid Express thermocycler-t (Teddington, Middlesex, UK) használtunk. Az amplifikáció után a PCR produktumokat 2 %-os agaróz gélen szeparáltuk 120 V-on, 30 percig. Ezt követően ethidium bromid festést alkalmaztunk D vitamin receptor gén BSM I A D vitamin receptor gén BsmI polimorfizmusát korábban leírt módszer szerint azonosítottuk 88 (primer VitDs: 5 CAA CCA AGA CTA CAA GTA CCG CGT 3 VitDa :5 :AAC CAG CGG GAA GAG GTC AAG GG 3 ). A PCR reakcióhoz 40 µl a végső térfogatban 4 µl 10-szeres Mg mentes puffert, 1 µl dntp-t (10mM), 4 µl 25 mm MgCl2-t, 10 µl DNS-t, 1-1 µl primer (Ds, Da :50 µm végkoncentrációban) és 19 µl 2D PCR water-t használtunk. Hot start után 8µL PCR water-t, 1µL 10-szeres Mg mentes puffert és 9,6 µl Taq polimerázt (Promega, Madison, USA) adtunk hozzá a reakcióhoz. A DNS-t 95 C-on 3 percig denaturáltuk (hold 85 C). Az amplifikáció három lépésben történt. Először 1 ciklusban (8 ciklus 72 C 3 percig, 94 C 30 másodpercig; majd 72 C 1 perc 45 másodpercig, 94 C 30 másodpercig, 71 C 1perc 45 másodpercig, 94 C 30 másodpercig, 40 C 1perc 45 másodpercig, 94 C 30 másodpercig, 69 C 1 perc 45 másodpercig, 94 C 30 másodpercig, 68 C 1 perc 45 másodpercig, 94 C 30 másodpercig), ezután 23 ciklusban (68 C 1 perc 45 másodpercig, 94 C 30 másodpercig), végül 8 ciklusban (72 C 3 percig, 94 C 30 másodpercig). A végső extenziót 72 C-on 15 percig végeztük. A DNS-t BsmI restrikciós enzimmel emésztettük 65 C-on 90 percig (BsmI, Hybaid, Teddington, UK). Az alléleket a nemzetközi nomenklatúrának megfelelően a BsmI restrikciós hely hiánya, B allél (825 bp) illetve jelenlétét, b allél ( bp) alapján neveztük el. Minden BB genotípust ismételt emésztésnek vetettünk alá, hogy a bb, Bb genotípusok biztonsággal elkülöníthetők legyenek. 30