Citokin-szint mérések

Átírás

1 Citokin-szint mérések Bekő Gabriella SE Laboratóriumi Medicina Intézet Központi Laboratórium (Pest) április 20.

2 A citokinek általános jellemzői Kis molekulasúlyú (8-40 kda) glikoproteinek Izolált sejtek termelik aktiváció hatására Sejtek közötti kapcsolatokat közvetítik: - információ-továbbítás - immunválasz szabályozása Hatásukra jellemző: - receptorokon keresztül hatnak - nagy affinitás a receptorokhoz - igen kis koncentrációban

3 A citokinek funkcionális csoportosítása I. Természetes immunitásban és gyulladásos folyamatokban résztvevők II. A limfociták aktivációját és differenciálódását szabályozók Proinflammatorikus hatásúak: IFNα, IFNβ, IFNγ, TNFα, TNFβ, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12, MIF, kemokinek (IL-8, MCP-1) Antiinflammatorikus hatásúak: IL-10, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24,IL-26 IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, IL-15, INFγ, TGFβ III. Az immunsejtek érésére hatók IL-3, IL-7, GM-CSF, G-SCF

4 A citokinek az immunválasz minden fázisában hatnak: Felismerés: Aktiváció: Effektor fázis:

5 Citokinek kapcsolata B-sejt T-sejt Hízósejt

6 Citokin-szint meghatározásának nehézségei A citokinszintek és növekedési faktorok meghatározását több tényező nehezíti: Az ugyanolyan néven, jellel jelzett citokin a szervezetben monomer és polimer formában is jelen lehet; Többféle alegységből áll, melynél az egyes alegységeket külön sejttípusok termelik; illetve kémiailag sem mindig jól karakterizáltak; Mind a citokin mind a növekedési faktorok meghatározásánál, mivel fehérjékről van szó, amelyek esetleg több epitóppal rendelkeznek, a szintek mérése során alkalmazott immunanalitikai módszerek szenzitivitását és specificitását, de a referencia tartományt is alapvetően meghatározza a gyártás technológiája, a vegyszer sorozatszáma;

7 Citokin-szint meghatározásának nehézségei Nyugalmi állapotban a citokinszintek a plazmában igen alacsony (pmol/ml) koncentrációban vannak jelen - jelentős hányaduk nem is detektálható; Stimulus hatására a citokinszint többszörösére emelkedik, de ez a változás átmeneti, citokinenként különböző kinetikát mutat; Mivel a citokinek hatásukat egy komplex rendszer részeként fejtik ki, sok esetben az 1-1 citokin klinikai jelentőségére korlátozódó mérések eredménye nem informatív

8 Mintavétel, tárolás Kortizolfüggő citokineknél diurnális ingadozás Módszerfüggő betegminta: szérum, plazma, szöveti felülúszó, testnedv, szöveti homogenizátum, heparinnal, citráttal vagy EDTA-val alvadásgátolt vér, alvadásgátolt vérből vagy szövettani mintából, biopsziából szeparált sejtek, csontvelőből, likvorból, ascitesből, ízületi folyadékból vagy bronchoalveoláris lavage-ból ülepített vagy szeparált sejtek, sejttenyészetek partikulái Metodika függő mintatérfogat Tárolás -70⁰C és -80 ⁰C között Egyszeri felolvasztás

9 Intracelluláris citokinek és kemokinek kimutatása áramlási citometriával A T-limphociták aktivációját követően a citokinek/kemokinek a citoplazmában feldúsulnak, és csak ezután választódnak ki Az intracelluláris citokinek a citoplazmában fluoreszcens festékekkel jelzett specifikus ellenanyagokkal, áramlási citofluorimetriával, immunhisztokémiai módszerekkel vagy immunfluoreszcens mikroszkópos technikákkal vizsgálhatók A sejtfelszíni markerek egyidejű kimutatásával az adott citokintermelő sejt típusa is azonosítható, és a citokint termelő sejtek aránya is megadható A mikroszkópos elemzés a sejten belüli lokalizáció meghatározására alkalmas

10 Visceralis Leismania ellen kialakuló hosszú távú immunitás esetén az intracelluláris citokinek szintje a CD4 + és CD8 + sejtekben A Selvapandiyan *, R Dey *, S Nylen, R Duncan *, D Sacks and H L. Nakhasi 1, Intracellular Replication-Deficient Leishmania donovani Induces Long Lasting Protective ImmunityagainstVisceralLeishmaniasisThe Journal of Immunology, 2009

11 Extracelluláris citokinek kimutatása ELISA technikával A citokinek klasszikus ELISA-val való kimutatásakor a kettős szendvics módszert alkalmazzák fajlagossága igen nagy Ezzel a módszerrel a citokinek mennyisége a biológiai aktivitásuktól függetlenül mérhető, ezért főként a rövid életidejű fehérjék esetében az eredmény nem mindig jelzi a tényleges biológiai aktivitást A mérést az is befolyásolja, hogy a különböző citokinek oldott formájú receptorokhoz vagy inhibitorokhoz kötött formában is előfordulhatnak

12 Citokinek mérése immunkémiai automatával Az "ECLIA" (elektrochemilumineszcens immunoassay ) Elecsys, Modular E és Cobas e immunkémiai analizátorokon alkalmazható módszer, mellyel Interleukin-6-ot mérhetünk humán szérumban és plazmában Az IL-6 az akut gyulladás korai indikátora, koraszülött és újszülöttkori szepszisben jól használható marker Immunolyte automatára IL6, IL8 és TNF-α teszteket fejlesztettek. Ezek a proinflamatorikus citokinek akut gyulladásban, sepsisben segíthetik a korai diagnózist. Az automatákon mért citokinszintek előnye egy-két órán belül, ügyeleti időben is elkészül az eredmény

13 Hong DS, Angelo LS, Kurzrock R. Interleukin-6 and its receptor in cancer: implications for translational therapeutics Cancer. 2008

14 IL-6 szerepe carcinomában Hong DS, Angelo LS, Kurzrock R. Interleukin-6 and its receptor in cancer: implications for translational therapeutics Cancer. 2008

15 IL-6 szerepe gyulladásban, szepszisben

16 IL-6 és IL-8 koncentrációk alakulása halállal végződő szepszis esetén S HARBARTH, K HOLECKOVA, C FROIDEVAUX et all: SepsisNetwork Diagnostic Value of Procalcitonin, Interleukin-6, and Interleukin-8 in Critically Ill Patients Admitted with Suspected Sepsis Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2006

17 A különböző biomarkerek értéke a szepszis előrejelzésében (ROC) analízissel Shawn D. Carrigan 1, George Scott 2 and Maryam Tabrizian Toward Resolving the Challenges of Sepsis Diagnosis Clinical Chemistry. 2004

18 Perinatális szepszis és citokinprofil Minden, a prokalcitonin és/vagy a CRP szint alapján szeptikus újszülöttnél magasabb volt az IL-6 szint. Az emelkedett IL-8 szintű 15 gyermek közül 6-nál az egészséges referenciatartományon belül volt a prokalcitonin és a CRP szintje; azaz az első napon 90 pg/ml feletti IL-8 és/vagy 2,5 µg/l feletti prokalcitonin- és/vagy 3 mg/l feletti CRP-szint a perinatális szepszis tüneteit mutató újszülöttek 95%-ánál jelen volt. Paraméterek Antibiotikum adása előtt (1. életnap) Antibiotikus kezelés alatti 1. nap (2. életnap) Antibiotikus kezelés alatti 2. nap (3. életnap) IL-6 (pg/ml) 18,2 (10,54 29,27) 8,2 (3,47 14,025) 4,3 (2,4 6,9) IL-8 (pg/ml) 66,16 (38,72 162,9) 50,34 (17,08 101,27) 52,26 (32,19 123,5) IL-10 (pg/ml) 3,555 (2,3 5,5) 2,945 (1,968 3,922) 2,165 (1,715 3,15) Prokalcitonin-szint (ng/ml) 15,56 (8,24 28,34) 1,535 (0,688 7,858) 0,35 (0,215 0,665) CRP-szint (mg/l) 2,5 (0,675 9,4) 1,7 (0,6 9,7) 0,7 (0,1 4,625) Fehérvérsejtszám (G/l) 15,7 (10,725 22,95) 10,75 (9 14,35) 12 (9,7 15,7)

19 IL-6 a Crohn-betegség aktivitásának követésében IL-6 szintek mérése valószínűleg felhasználható a betegség aktivitásának követésére immunszuppresszív kezelés bevezetését követően, a terápiás válasz korai kimutatásában, szemben a hagyományosan vizsgált laborparaméterekkel Müllner, Katalin Edit (2007) Endotoxinok, citokinek, szabad gyökök szerepének, farmakogenetikai eltéréseknek a vizsgálata Crohnbetegség kezelésében és aktivitásának nyomon követésében

20 Multiplex rendszerek I. Biochip technika Egyszerre 12 citokint, kemokint és növekedési faktort mérünk 100 µl mintából A mérés elve háromféle immunoassay EGYÜTTES alkalmazása : 1. kompetitív immunoassay (enzimmel jelölt analit) 2. sandwich immunoassay (enzimmel jelölt antitest) 3. antibody capture immunoassay A Randox Evidence Investigator TM a chemiluminescens jeleket egyszerre méri egy hűtött CCD kamerával és standard kalibrációs görbékhez hasonlítva kiértékeli egy speciális programmal a teljes array-n.

21 Biochip citokin panelek Cytokine Array I [serum & plasma] Epidermal Growth Factor (EGF) Interleukin-1 alpha (IL-1a) Interleukin-1 beta (IL-1b) Interleukin-2 (IL-2) Interleukin-4 (IL-4) Interleukin-6 (IL-6) Interleukin-8 (IL-8) Interleukin-10 (IL-10) Interferon- gamma (IFN-g) Monocyte Chemotactic Protein-1 (MCP-1) Tumour Necrosis Factor-alpha (TNF-a) Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Cytokine Array III [serum & plasma] Interleukin-5 (IL-5) Interleukin-15 (IL-15) Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) Macrophage Inflammatory Protein - 1alpha(MIP-1a) Tumour Necrosis Factor beta (TNF-b) Cytokine Array IV [serum] Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) Soluble IL-2 Receptor Alpha (sil-2ra) Soluble IL-6 Receptor (sil-6r) Soluble Tumour Necrosis Factor Receptor I (stnfri) Soluble Tumour Necrosis Factor Receptor II (stnfrii)

22 A világ első Protein Biochip Array teljes automata rendszere teljesen automatizált rendszer a panelek gyors multiplex vizsgálatára 1200 vizsgálat / óra.

23 Teljes automata (EVIDENCE) Ebben a rendszerben egy chip felületére maximum 23 analit (antitest) köthető. Panelek: kardiális, cerebrális, pajzsmirigy, női hormon, drog kimutató, anti-mikrobiális, szintetikus szteroid, adhéziós molekula, és többféle tumor monitorozó proteinarray, a colorectalis tumorok szűrésére pedig DNA-arrayt (RanplexCRC), Nyugat-Európában, Amerikában klinikai rutin laboratóriumokban is használják.

24 Multiplex rendszerek II. Bio-Plex technika Mikrogyöngyöket vörös és infravörös festékkel színezik. 100-féle gyöngytípus befogó molekula analit jelző molekula A gyöngyökhöz monoklonális antitesteket kötnek, a citokin jelenlétekor fluoreszcens jel keletkezik. A gyöngyök összekeverhetők és a microplate lyukaiból egyszerre mérhetők. A gyöngyöket 2 színűlézer világítja meg. Piros fény a gyöngy típus zöld fénya fluoreszcens jel intenzitás Egyszerre akár 27-féle citokin 50 µl mintából!

25 Citokinszint-mérő technikák összehasonlítása Az egyes rendszerekben mért IL-6 szintek szorosan összefüggtek egymással. IL-6 szint Roche, Biochip és Biop lex módszerrel IL-6 (pg/ml) beteg azonosító IL-6 (Roche) IL-6 Biochip IL-6 Bioplex A Bioplex rendszerrel mért IL-6 szintek közel szignifikáns mértékben magasabbak voltak, mint az Roche (p = 0,07), illetve Biochip (p = 0,06) rendszerrel mért értékek. A Bioplex és a Biochip rendszerekkel mért citokinszintek közötti összefüggés erőssége citokintől függően tág határok között változott (r = 0,28 0,97).

26 Biochip és Bioplex rendszer összevetése a multiplex citokin-szint-meghatározás IL-6-szint mindig, IL-2, IL-8, IL-10, TNF-α, IL-4, IFNγ csak az esetek egy részénél mérhető egészséges felnőttekben Az egyes mérési rendszerekkel kapott eredmények bár bizonyos esetekben szoros kapcsolat áll fenn közöttük alapvetően rendszerspecifikusak. Fontos, hogy egy adott laboratórium egy adott kísérlethez mindig ugyanazt a rendszert alkalmazza. Az egy adott rendszerrel mért citokin értékek nem használhatóak fel olyan kísérletek során, melyekben egyéb módon (is) mértek citokinszinteket. Az esetenként gyenge erősségű összefüggéseken túl az egyes rendszerekkel mért citokin-szintek között szisztémás eltérést is kimutattunk. Egyes rendszerek esetében a vizsgálatot végző laboratóriumnak külön-külön meg kell határoznia az egészséges populációra vonatkozó referenciaértéket, továbbá hogy milyen módszerrel történt a meghatározás.

27 Cirrhosisra jellemző citokinprofilok Citokinek (pg/ml) Egészséges referenciacsoport Alkoholos cirrhosis Primer biliaris cirrhosis HCV-fertőzés okozta cirrhosis n = 26 n = 36 n = 35 n = 14 IL-10 1,08 [0,0-2,07] 1,20 [0,12-2,71] 0,47 [0,0-3,32]* 1,08 [0,42-2,86] IL-1β 1,57 [0,0-4,32] 1,17 [0,0-3,31] 0,72 [0,0-3,21] 1,57 [0,0-2,97] IL-2 4,18 [0,0-6,83] 5,50 [3,95-13,2] 4,88 [0,0-9,12] 8,18 [3,24-13,8]* IL-6 1,51 [0,74-4,89] 10,8 [1,02-24,7]* 5,72 [0,0-17,6]* 4,80 [0,0-9,46] IL-8 25,2 [6,84-48,1] 49,2 [7,72-138] 159 [14,9-305]* 17,7 [3,88-7,2] TNFα 7,45 [2,54-14,4] 8,58 [2,15-17,51] 11,4 [0,0-31,3]* 4,81 [1,94-8,62] * p< 0,05 az egészséges referenciacsoporthoz képest

28 Jellemző citokinprofil és összefüggés a diagnosztikában használt paraméterekkel Rheumatoid arthritisben Our objective was to analyse the relationship between circulating cytokines, autoantibodies, acute phase reactants, and disease activity in DMARDs-naïve rheumatoid arthritis (RA) patients (n=140). All cytokines were significantly higher in the RA cohort than in healthy controls. Moderate-to-strong positive intercorrelations were observed between Th1/Th2/macrophage/fibroblast-derived cytokines. RF correlated significantly with IL-1β, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, and TNF (P<.0001), and accp (anticyclic citrullinated peptide antibodies) and amcv (antimodified citrullinated vimentin antibodies) with IL-1β, IL-2, IL-4, and IL-10 (P<.0002), while IL-6 correlated best with the acute phase reactants, CRP and SAA (P<.0001). Circulating Cytokine Profiles and Their Relationships with Autoantibodies, Acute Phase Reactants, and Disease Activity in Patients with Rheumatoid Arthritis Mediators of Inflammation 2010

29 A citokinprofil értéke A labordiagnosztika mai színvonala lehetővé teszi, hogy ne csak izoláltan, egy-két citokinre vonatkozóan lehessen adatokat gyűjteni, hanem meg lehessen határozni az egy adott betegre, betegségre jellemző citokinprofilt. Az eredmények értékelését nehezíti: (1) nem ismert, hogy a különböző multiplex rendszerek által mért adatok mennyire állnak összhangban; (2) kevés az arra vonatkozó adat, hogy az egy adott multiplex rendszerben mért értékek mennyire reprodukálhatóak; (3) a nagyszámú adat feldolgozása, az egy adott betegből ismételten végzett mérések eredményének az értékelése új statisztikai megközelítéseket indokolnak.

30 Köszönöm a megtisztelő figyelmet!

31