Az áramlási citométer és sejtszorter felépítése és működése, diagnosztikai alkalmazásai

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Az áramlási citométer és sejtszorter felépítése és működése, diagnosztikai alkalmazásai"

Lajos Gulyás
9 évvel ezelőtt
Látták:

1 Az áramlási citométer és sejtszorter felépítése és működése, diagnosztikai alkalmazásai Az áramlási citométer és sejtszorter felépítése és működése Kereskedelmi forgalomban kapható készülékek 1

működése Kereskedelmi forgalomban kapható

2 Fogalmak Áramlási citometria (flow cytometry) Eljárás vagy mérési módszer, amellyel folyadékáramban lévő önálló részecskék, pl. biológiai sejtek egyedi tulajdonságait fizikai, kémiai, biokémiai, biológiai jellemzőit - tudjuk lemérni Flow Sorting Sejtek vagy részecskék elkülönítése, elválasztás mért paramétereik szerint, fizikai elválasztás FACS: Fluorescence-Activated Cell Sorting Eredetileg csak a szorting folyamatot nevezték így, ma az analizátorokra is használják (Valójában helytelenül). Milyen funkcókra képes egy flow citométer? Részecskék sejtek - számlálása sejtszupenzióban Biologiai és nem biologiai elkülönítése Élő és nem élő részecskék, sejtek elkülönítése számú részecske mérése 1 percen belül Részecskék fényszórásának és/vagy belső fluorescenciájának mérése Sorting: egyedi részecskék elkülönítése 2

fizikai elválasztás FACS: Fluorescence-Activated Cell Sorting Eredetileg csak a szorting folyamatot nevezték így, ma az analizátorokra is használják (Valójában helytelenül).

3 A mérések alapelvei A részecskék egy hidrodinamikailag fókuszált folyadékáramban haladnak át egy gerjesztő fénynyalábon (lézer, Hg-gőz lámpa, stb.) Fény szórásjelek detektálása Specifikus fluoreszcencia detektálása Multiparaméteres adat analízis Electrosztatikus vagy mechanikus részecske szeparálás: szorting Technikai felépítés Fényforrás Áramlási rendszer (folyadék) Optikai rendszer Detektáló rendszer Adatgyűjtés Adat analízis Szorting 3

) Fény szórásjelek detektálása Specifikus fluoreszcencia detektálása Multiparaméteres adat analízis

4 Az áramlási tér jelentősége, tulajdonságai: Hidrodinamikai fókuszálás Áramlási citométer cella 4

5 Hidrodinamikai rendszer Hidrodinamikai fókuszálás A köpenyfolyadék koncentrikus körökben veszi körül a mintafolyadékot (lamináris áramlás). Ezáltal a mintafolyadékot az áramlási fej közepére fókuszálja A hidrodinamikai fókuszálás célja: a sejtek ott haladjanak,ahol a lézer megvilágítja őket. 5

Ezáltal a mintafolyadékot az áramlási fej közepére fókuszálja A

6 Az áramlási citométer optikai felépítése, optikai jelek detektálása Technikai komponensek Fényforrás: Gerjesztő/megvilágító rendszer Lézerek ( , 420, 457, 488, 514, 532, 600, 633 nm) Argon ion, Krypton ion, HeNe, HeCd, Yag, szilárdtest Ívlámpák Higany-gőz, Hg-Xenon (megfelelő vonalak Detektáló rendszer Fotomultiplier csövek (PMTs) Fotodiódák Régebben 1-2 cső Jelenleg akár db. Többnyire az előre irányuló szórás (FSC) mérésére 6

HeNe, HeCd, Yag, szilárdtest Ívlámpák Higany-gőz, Hg-Xenon (megfelelő vonalak Detektáló rendszer

7 7

8 8

9 9

10 Analóg jelek FSC SSC FITC Lézer késleltetés APC A memóriában megjelenő számok digitális készülékben 10

11 A számok konvertálása paraméterekké Jelszélesség: Mintavételek száma Csúcsmagasság: A legnagyobb számérték Terület: A számok összege Nincs holtidő!!! Mérési eredmények tárolása, mentése 11

12 Az adatok tárolása Az adatok elmentése ún. FCS (flow cytometry standatrd) file-ban történik, ahol minden sejtről elmentik az összes mért adatot = list mode file Az adatok megjelenítése II. Kétdimenziós ábrázolási módok: 1. Dotplot: A 2 tengelyen 1-1 mért paramétert tűntetünk fel, az ábrán minden pont egy sejtnek felel meg 2. Density plot: az ábrán minden pont színe a sejtek számát jelenti. 3. Contour plot: az azonos sejtszámú pontokat vonalakkal kötik össze. 4. 3D (surface,felszín) ábra: a sejtek számát a z tengelyen ábrázolják (ritkán alkalmazott) 12

megjelenítése II. Kétdimenziós ábrázolási módok: 1.

13 Kapuzás Az összes lemért FL4 eloszlása. Csak a piros kapun (limfociták) belül lévő sejtek FL4 eloszlása. Fluoreszcens jelölés A fluoreszcencia alapjai 13

14 Felületi marker analízis A leukociták és (más sejtek) jellegzetes molekula kombinációt expresszálnak a sejt felszínén,ami függ A sejtek típusától A sejtek differenciálódási stádiumától A sejtek aktivációjától, inaktivációjától A sejtek egyéb funkcionális állapotától A kóros elváltozásoktól,differenciálódási mechanizmusoktól Tipikus detektálásuk monoklonális antitestekkel történik Áramlási citometriás célra az antitesteket fluoreszcensen jelöljük: direkt, indirekt Fluoreszcens festékekkel szemben támasztott követelmények: Emittáljanak olyan hullámhosszon, ahol kicsi az autofluoreszcencia Az emissziós spektrumuk a lehető legkisebb átfedést mutassa a többi festék spektrumával (kompenzáció) Kvantumhatásfokuk, abszorpciós együtthatójuk legyen magas, azaz produkáljanak erős, jól detektálható fluoreszcenciát (érzékenység) Aspecifikus kötődésük legyen kicsi Legyenek olcsók A fehérjék (antitestek) jelölése egyszerű protokollal legyen megvalósítható Ne módosítsák jelentősen a jelölt molekula tulajdonságait 14

citometriás célra az antitesteket fluoreszcensen jelöljük: direkt, indirekt Fluoreszcens festékekkel szemben támasztott követelmények: Emittáljanak olyan hullámhosszon, ahol kicsi az

15 Az áramlási citométer diagnosztikai alkalmazásai Immuntipizálás áramlási citometriával 15

16 Sejtciklus és DNS tartalom analízis 1. A sejteket fixáljuk és permeabilizáljul, hogy a DNS festék hozzáférjen a DNS-hez. 2. A DNS festék (pl. propidium jodid) eljut a sejtmagba, és ott sztöchiometrikusan kötődik a DNS-hez. 3. A mért fluorszcencia intenzitása arányos a sejt DNS tartalmával. Alkalmazási terület: Daganatos sejtek A normálisnál magasabb DNS tartalommal rendelkeznek Magasabb S és G2/M aránnyal rendelkeznek KÖSZÖNÖM A FIGYELMET 16

propidium jodid) eljut a sejtmagba, és ott sztöchiometrikusan kötődik a DNS-hez. 3.

Hasonló dokumentumok

2011.11.25. Modern Biofizikai Kutatási Módszerek 2011.11.03. Kereskedelmi forgalomban kapható készülékek. Áramlási citometria (flow cytometry)

2011.11.25. Modern Biofizikai Kutatási Módszerek 2011.11.03. Kereskedelmi forgalomban kapható készülékek. Áramlási citometria (flow cytometry) Modern Biofizikai Kutatási Módszerek 2011.11.03. Kereskedelmi forgalomban kapható készülékek Áramlási citometria (flow cytometry) Eljárás vagy mérési módszer, amellyel folyadékáramban lévő önálló részecskék,