Bevezetés a fluoreszcenciába

Átírás

1 Bevezetés a fluoreszcenciába Gerjesztett Excited Singlet szingulett Manifold állapot S1 Jablonski diagram Belső internal konverzió conversion S2 k isc k -isc Triplett állapot Excited Triplet Manifold T1 k nr k k' f nr fluoreszcencia fluorescence k p phosphorescence foszforeszcencia ntersystem crossing Triplett állapot S Singlet szingulett Ground alapállapot State Belső konverzió Kasha szabály Triplett állapot foszforeszcencia; szignifikánsan hosszabb élettartam Mi a fluoreszcencia? Relaxációs lehetőségek a fluorofór molekula gerjesztett állapotból történő visszatérése foton Abszorpció(1) eredményeként jön létre a folyamat Magasabb E és vibrációs állapot Legalacsonyabb E szingulett gerjesztett szingulett állapothoz vezet, S 1 S 1 állapotból szubnanoszekundumos relaxáció (2) következik Abszorpció ΔE Triplett állapotba történő Tiltott átmenet melyet spektrálisan a vörös hullámhossztartomány (3) felé eltolt fényemisszió követ (Stokes féle eltolódás) a Stokes féle eltolódás teszi a fluoreszcenciát érzékeny spektroszkópiás technikává fluoreszcencia foszforeszcencia késleltetett fluoreszcencia alapállapot Az első szingulett gerjesztett állapotból való visszatérésre többféle alternatíva kínálkozik a molekula számára

2 A különböző relaxációs folyamatok élettartamai 1. gerj. állapot alapállapot szingulett állapot triplett állapotok ntenzitás Hullámhossz

3 Fluoreszcencia paraméterek Abszorpciós spektroszkópia Ahhoz, hogy karakterizáljuk egy ismeretlen molekula rendszer fotoindukált emisszióját, meg kell határoznunk a hullámhossz függvényében az abszorpció és emisszió spektrális eloszlásait, a kvantumhatásfokot a gerjesztett állapot élettartamát az emittált fluoreszcencia polarizáltsági fokát Gregorio Weber, Meth. Enzym. 278, p. 1 (1997) spektrális eloszlás Kibocsájtási (emissziós) spektrum: Rögzített gerjesztési hullámhossz mellett mérjük a fluoreszcencia intenzitás hullámhossz függését Gerjesztési (excitációs) spektrum: Rögzített emissziós hullámhossz mellett mérjük a gerjesztési spektrumot (hullámhossz függvényében) : általában ua. mint az abszorpciós spektrum T = abszorbeáló c koncentrációjú közeg Transzmittancia úthossz l A A = log T = log T = ε ( λ )cl = log Abszorbancia ( 1 ε λ = Lambert-Beer ) cl Spektrális eloszlás Spektrális eloszlások meghatározása Spektrofotométer Normalizált fluoreszcencia intenzitás Normalized ill. Abszorbancia Fluo. ntensity 1. ECFP chromophore.8 5 nm det. 434 nm exc..6 Tryptophan Hullámhossz Wavelength [nm] [nm] fényforrás Monokromátor Minta Detektor Fluoreszcencia gerjesztés Hullámhossz, nm Fluoreszcencia emisszió

4 Spektrális eloszlások meghatározása Fluoreszcencia élettartamok Spektrofluoriméter fényforrás Monokromátor Minta az összes kompetáló folyamat befolyásolja a mérhető élettartamot. dn dt = N ( k f + k ic + k isc ) Fluoreszcencia gerjesztés Fluoreszcencia emisszió Detektor fluoreszcencia intenzitás gerjesztő impulzus τ int N= N e = 1 ( kf + kic+ kisc) t k + k + k f ic Q = k f τ isc Hullámhossz, nm Fontos Fluoreszcencia paraméterek Fluoreszcencia élettartamok Kvantumhatásfok a festék emissziós képességének jellemzője # emittált foton Q = # abszorbeált foton fluor. átm. v.sz. Q = összes átm. v.sz. ntenzitás egyenesen arányos az anyag abszorpciós képességével (extinkciós együttható, ε) Kvantumhatásfok, Q F = ε[]lq c ahol a belépő gerjesztő fény intenzitása, l a gerjesztési úthossz [c] festék (fluorofór) koncentráció Q = k f k + k f ic + k isc teljes fluoreszcencia Fluoreszcencia élettartam (τ) karakterisztikus idő melyet a fluorofór a gerjesztett állapotban tölt. τ = 1/( k + k + k int f A gerjesztett állapotban töltött idő alatt a molekula a környezetével számos kölcsönhatáson megy át. kollíziós kioltás fluoreszcencia energia transzfer intersystem crossing rotációs mozgás Homogén rendszer esetén (fluorofór + oldat) az élettartam egy komponensből áll Heterogén rendszerek esetén többkomponens mérhető ic isc )

5 Fluorofórok-2 Közönséges fluorofórok exogén festékek Fluorescein, Rhodamine, Acridine Orange, Ethidium Bromide, Cy endogén fluorofórok - NADH autofluoreszcencia, stb. FLUORESCEN Molekuláris képlet: C 2 H 12 O 5 Molekula tömeg: Mi az a fluorofór? Fluorofórok olyan molekula amelyik fluoreszkál néhány aminosav, különösen Trp, Tyr és Phe Flurofórok-3 Fehérjék Phycobiliproteins - phycoerythrin, allophycocyanin Green Fluorescent Protein - GFP Új festékek nanokristályok (core/shell quantum dots)

6 Gyakran használt fluorofórok Fluoreszcencia mérése Spektrofluoriméter excitációs és emissziós spektrum monokromátor oldatok vizsgálata (küvettában) Fluoreszcens mikroszkóp fluoreszcencia eloszlás biológiai rendszerek (sejtek stb.) vizsgálata. optikai szűrők használata Fluorofórok néhány alkalmazása Fluoreszcencia mérése mmunofluoreszcencia ion szenzitív festékek -K +, Na +, Ca 2+ specifikus markerek -ph indikátorok membránpotenciál megnövekedett intracelluláris fluoreszcencia DNS festékek fehérje fluoreszcencia meghatározási módszerek

7 Fluoreszcencia mérése Optikai szűrők Optikai szűrők Optikai szűrők -2 kibocsátott fény Tipikus filter elrendezés mikroszkópban gerjesztő fény minta

8 Fényforrások Fluoreszcens képalkotás FTC-el (fluorescein isothiocyanate) és Rhodamine-phalloidin-nal jelölt sejt a microtubulusok és az aktin filamentumok látahtóvá tételére. Optikai szűrők kiválasztása Wild Type GFP Fluorescence Excitation Fluorescence Emission Wavelength, nm Chroma Technology 32 WTGFP Bandpass Filter Set

9 Tumor sejtek aneuploidiájának kimutatása FSH-el FRET Fotofizikai következményei D* A* FRET esetén a donormolekula számára létezik egy alternatív relaxációs lehetőség Energia Transzfer esetén Donor gerjesztett állapotának (D*) élettartama csökken Donor fluor. intenzitása csökken Donor photobleaching (fotohalványítás) sebességi állandója csökken Akceptor fluoreszcencia intenzitása ( ha a donor jelen van) növekszik D* Fluoreszcencia Rezonancia Energia Transzfer (FRET) Donor és akceptor távol egymástól - No FRET A Donor és akceptor közel egymáshoz - FRET fénykibocsátás nélküli (elektromágneses dipólus-dipólus) átmenet a gerjesztett kromofór (donor) felöl a receptor molekula (akceptor) fele. dinamikus Förster transzfer folyamat meglehetősen távolságfüggő 1/R 6 hatékony eszköz molekula asszociációk, fehérje-fehérje, receptor-ligand kölcsönhatások vizsgálatára FRET távolság tartománya: 2-1 nm D* A* FRET detektálása Spektrális változások akceptor fluoreszcencia intenzitása növekszik donor fluoreszcencia csökken Fluoreszcencia élettartam Csökkenő donor oldali élettartam Donor Photobleaching (fotohalványítás) a donor molekulák un. photobleaching sebességi állandója akceptor jelenlétében csökken Akceptor Photobleaching erős, akceptort gerjesztő fényt alkalmazva akceptor mentes terület megnövekedett donor fluoreszcencia

10 Alkalmas FRET festékpárok kiválasztása Fluorofórok fotoszelekciója polarizált gerjesztő fény segítségével Normalized Fluo. ntensity ECFP/EYFP ECFP, ex ECFP, em EYFP, ex. EYFP, em Wavelength, nm vertikálisan polarizált gerjesztő fény kiválasztott populáció A Förster típusú energiatranszfer hatásfok távolságfüggése Minta p= VV VV G + G VH VH r= VV VV Monokromátor Polarizátor G +2G VH VH E = 6 R R + R 6 6 Detektor G = HV HH

11 1 r 1 kt = 1 + τ r Vη fotonszám idő