Biomolekuláris szerkezet és dinamika vizsgálata. Gerjesztés során elnyelt energia sorsa. Fluoreszcencia és különleges alkalmazásai

Átírás

1 Biomolekuláris szerkezet és dinamika vizsgálata Fluoreszcencia, egymolekula biofizika, rádióspektroszkópiák (EPR, NMR, MRI) John Dalton ( ) 1 nm Oxigén atomok rhodium egykristály felületén Cary and Michael Huang ( Fluoreszcencia és különleges alkalmazásai Energiaátmenetek atomban Növekvő energiájú pályák Fénykibocsátás: E=hf Egy molekula energiáját mozgásállapota is befolyásolja Vibráció Alapállapot Gerjesztett energiaállapotok Gerjesztés (energia elnyelés) Energiaátmenetek molekulában Elektron energiaszint Sugárzásmentes relaxációs folyamatok Fénysugárzással járó relaxáció: fluoreszcencia Vibrációs energiaszint Fluoreszcencia genetikailag módosított fajban: Zöld egér GFP: ~27 kda, 238 aa;11-szálú β-hordó; kromofór a központi hélix Ser65-Tyr66- Gly67 oldalláncaiból Gerjesztés során elnyelt energia sorsa Belső konverzió (hő) Rendszerek közötti átmenet S T Fluoreszcencia (ns) Foszforeszcencia (ms) k isc k f k ic ENERGIA k Q k FRET Fluoreszcencia kioltás ( quenching ) Förster Rezonancia Energia Transzfer (FRET) Sugárzásos és nem sugárzásos átmenetek!

2 Förster Rezonancia Energia Transzfer (FRET) A gerjesztett állapotban lévő molekula (donor), valamint egy megfelelő spektroszkópiás követelményeket kielégítő molekula (akceptor) között dipól-dipól kölcsönhatás révén, sugárzás nélküli energiaátadás formájában jön létre. Fluoreszcencia Rezonancia Energia Transzfer (FRET): ha az energiatranszfer szereplői fluorofórok. hν - D + hν E ~ k FRET ~ 1/R 6 R A + - hν Theodor Förster ( ) A gerjesztett donor (D) relaxációjához hozzájárul az akceptor (A) molekula emissziója! A FRET feltételei Fluoreszcens donor (D) és akceptor (A) molekula. A donor és akceptor molekula közötti távolság (R) 2-10 nm! Átfedés a donor emissziós spektruma és az akceptor abszorpciós spektruma között. E = R 0 6 R R 6 R0: Förster-távolság (Az a távolság melyen a FRET hatásfok felére csökken: transzferhatásfok 0.5) R: A fluorofórok (D-A) közötti aktuális távolság Fl intenzitás ill. OD Spektrális átfedés (átfedési integrál) Hullámhossz (nm) A FRET alkalmazása Molekuláris mérőszalag: távolságmérés a nm-es (10-9 m) tartományban. Nagyon érzékeny (lásd hatvány összefüggés)! Alkalmazás: Molekulák közötti kölcsönhatások tanulmányozása. Molekulákon belüli szerkezeti változások tanulmányozása. Érzékenyített fluoresczencia video mikroszkópia Izom Izomrost Szarkomer Miofibrillum In vitro motilitási próba FRET mikroszkópia Donor emisszió Akceptor emisszió 50 μm Transzfer hatásfok Rodamin-jelölt aktin filamentumok motilitása - érzékenyített epifluoreszcencia videomikroszkópia Vastag filamentum Szubsztrát

3 Multifoton fluoreszcencia mikroszkópia Két (vagy több) foton energiája összeadódik a gerjesztéskor Gerjesztés (következésképp emisszió) csak a fókuszpontban (limitált fotokárosítás) Gerjesztés nagy (közeli IR) hullámhosszú, rövid (fs) fényimpulzusokkal Nagy hullámhossz miatt mély optikai behatolás (akár 2 mm) Egyedi fluoreszcens molekulák feloldása: Szuperfelbontású mikroszkópia Feloldási probléma (Abbé-elv) Kémiai Nobel-díj, 2014 A feloldási problémát pozíciómeghatározási problémává alakítjuk Pozíciómeghatározási probléma (pontosság a fotonszámtól függ) Sztochasztikus adatgyűjtés egyedi fluorofórokról Gerjesztés Foton λ=400 nm λ=800 nm ALAPÁLLAPOT Gerjesztés Foton x2 d d = 0.61λ n sinα STORM ( stochastic optical reconstruction microscopy ); PALM ( photoactivated localization microscopy ) Egyfoton fluoreszcencia Kétfoton fluoreszcencia Mikrotubulusok Bekapcsolt fluorofórok 1 Bekapcsolt fluorofórok 2 Feloldás:! =! λ " "##$%α N: fotonszám Agykérgi piramissejtek Zöld: proximális vesetubulusok; Vörös: albumin (plazma) Adatgyűjtési folyamat Bekapcsolt fluorofórok 3 Bekapcsolt fluorofórok 4 Pozíciókból számított kép Mikrotubuláris rendszer 1. Egyének (tér- időbeli trajektóriák) azonosíthatók sokaságban Sokaság - mikrotubuláris rendszer Egymolekula biofizika Egyedi mikrotubulusok - treadmilling Sokaság - intenzitás 2. Sztochasztikus eseményeket fedezetünk fel Intenzitás (a.u.) Egyedi kvantumpont - pislogás Rugólapka módszerek Egyedi molekulák manipulálása Üveg mikropipetta Mikrofabrikált laprugó Atomi erőmikroszkóp (AFM) Lézernyaláb kitérés Rugólapka lehajlás 3. Párhuzamos útvonalon haladó folyamatokat ismerhetünk meg Kigombolyodott állapot 4. Biomolekulák mechanikáját jellemezhetjük von Willebrand faktor Kinezin talapzat F1F0 ATPáz Riboszóma Mező alapú módszerek Foton mező (lézercsipesz) Latex gyöngy Hidrodinamikai mező (Stokes) Mágneses csipesz Paramágneses gyöngy Fényemisszió Fényemisszió Konformációs tér Natív állapot Mozgatható mikropipetta

4 Mérhető paraméterek I. Erő Mekkora erő fejlődik egy dsdns molekula nyújtásakor? Mérhető paraméterek II. Távolság Mekkorát lép egy motorfehérje? Lézercsipesz Latex gyögy DNS Erő (pn) Szerkezeti túlnyúlás Entalpikus tartomány Miozin V molekula Távolság (nm) mozgatható mikropipetta Megnyúlás (µm) Entrópikus tartomány Miozin V krioelektronmikroszkópiás felvételsorozat Lézercsipesz (erővisszacsatolt, követi a mozgást) Mérhető paraméterek II. Elfordulási szög Hogyan működik az ATP szintáz? Mérhető paraméterek I. Fluoreszcencia Milyen állapotok között fluktuál egy molekula? Foszfoglicerát kináz (PGK) Kimogram Külső tér Mitokondrium belső membrán Belső tér 1 mm ATP 200 nm ATP 20 nm ATP Diszkrét 120 rotációs lépések Aktin filamentum Körbefordulás 50 μm Intenzitás (a.u.) Idő Fotokifehéredés egy lépésben (sokaságban exponenciális függvény!) fluoreszkáló állapot kifehéredett állapot PGK molekulák Alexa488-cal jelölve, TIRF mikroszkópia

5 Sokaság versus egymolekula viselkedés Rádióspektroszkópiák : forradalmasították a fizikát, kémiát, biológiát és orvostudományt Elektronspin rezonancia (ESR, elektron paramágneses rezonancia - EPR) Sokaság: [Termék] [Enzimszubsztrát komplex] Exponenciális lecsengés Mágneses magrezonancia (NMR, MRI) EPR spektroszkópia NMR spektroszkópia Ferhérje molekuláris dinamika NMR-rel Nagyfelbontású, anatómiai MRI Egyedi molekula: [Termék] lépcsők jelenhetnek meg [Enzimszubsztrát komplex] Fluktuáció diszkrét állapotok között MRI spektroszkópia MRI angiográfia Funkcionális MRI (fmri) Diffúziós MRI (tractographia) Musculoskeletalis MRI Atomi, molekuláris rendszerek elemi mágnesként viselkedhetnek Eredő spinnel rendelkező rendszerek: elemi mágnesek Stern-Gerlach kísérlet (1922) Otto Stern ( ) Walther Gerlach ( ) Az eredő mágneses dipólmomentumot az 5s 1 elektron adja (pályaperdület=0) Inhomogén mágneses térben nemcsak forgatónyomaték, hanem eredő erő is hat a mágneses dipólra: A nyaláb két részre hasad A spin mágneses momentum két értéket vehet fel. Elemi részecskék (p, n, e) saját spinnel rendelkeznek. Az elemi részecskék száma és bizonyos rendező elvek (pl. Pauli-elv) miatt a rendszerben eredő spin léphet fel. Atommag: páratlan tömegszám - feles magspin ( 1 H, 13 C, 15 N, 19 F, 31 P); páros tömegszám, páratlan rendszám - magspin egész; páros tömegszám és rendszám - magspin zérus. Elektron: eredő elektronspin stabil párosítatlan elektront tartalmazó rendszerekben (pl. szabad gyökök). Töltés és eredő spin miatt mágneses momentum lép fel. Magmágneses momentum: Mágneses magrezonancia ( nuclear magnetic resonance, NMR) Nobel-díj, 1952 γ N = atommag giromágneses hányadosa (mágneses momentum és perdület aránya) L = magspin ( ), ahol l=eredő spinkvantumszám. Elektronspin mágneses momentuma: Isidor Rabi ( ) Felix Bloch ( ) Mágneses rezonancia: Mágneses térbe helyezett minta általi, rezonancia-abszorpció jellegű elektromágneses energia elnyelés. Edward Mills Purcell ( ) Pörgettyűmodell g = elektron g-faktora (a mágneses momentum és giromágneses hányados kapcsolatát leíró dimenziónélküli arányszám) μ β = Bohr magneton (az elektron mágneses dipólmomentumának egysége) S = spinkvantumszám

6 Mágneses tér hiányában: elemi mágnesek orientációja random Paramágnesség: külső mágneses tér hatására fellépő mágnesezettség (mágneses dipólok orientációja). Mágneses térben: Precesszió Klasszikus ( pörgettyű ) modell szerint - Precessziós vagy Larmor frekvencia: ω 0 =γb 0 f Larmor = γ 2π B 0 elemi mágnesek orientálódnak B 0 parallel E energiaszintek felhasadnak Rezonanciafeltétel: ΔE Rezonanciafeltétel: ΔE=hf Pörgettyű, giroszkóp antiparallel B 0 B Felix Bloch, 1946 NMR és EPR spektroszkópia Makroszkópos mágnesezettség különböző energiaszinteken spintöbblet miatt NMR spektrum: elnyelt elektromágneses sugárzás intenzitása frekvencia függvényében. NMR-vonal görbe alatti területe az abszorbeáló atommagok számával arányos. Elektronfelhő (i.e., annak szerkezete) befolyásolja a lokális mágneses teret: frekvenciafeltétel elhangolódik ( kémiai eltolódás ). Kémiai szerkezetmeghatározás lehetősége. Acetaldehid NMR spektruma B 0 M μ i B 0 = mágneses tér M = makroszkópos mágnesezettség Alacsony energia állapot proton esetében parallel EPR spektrum: elnyelt elektromágneses sugárzás intenzitása a mágneses tér függvényében. NMR-énél alacsonyabb mágneses tér, de nagyobb elektromágneses sugárzási frekvenciák (mikrohullám). Spin-jelölés: stabil párosítatlan elektront tartalmazó vegyülettel való jelölés. Mozgási (rotációs) sebességek mérési lehetősége a s időtartományban. Mágneses tér (G) Spinjelölt citokróm-c ESR spektruma Magas energia állapot proton esetében antiparallel

7 Gerjesztés rádiófrekvenciás elektromágneses sugárzással Spin-rács relaxáció T1 vagy longitudinális relaxáció Rezonancia feltétel: Larmor frekvencia M z M B 0 = mágneses tér M = makroszkópos mágnesezettség B 1 = besugárzott rádiófrekvenciás elektromágneses tér B 1 T1 relaxációs idő: elemi mágnes (proton) és környezete közötti kölcsönhatásra utal t Spin-spin relaxáció T2 vagy tranzverzális relaxáció MRI: az emberi test makroszkópos mágnesezettségét hozza létre Nobel-díj (2003) M xy free induction decay (FID) t Raymond V. Damadian (1936-) Paul C. Lauterbur (1929-) T2 relaxációs idő: elemi mágnesek (protonok) közötti kölcsönhatásra utal Ábra Damadian szabványügyi bejelentéséből indomitable : a rettenthetetlen Peter Mansfield (1933-)

8 MRI képalkotás I: Térbeli felbontás NMR jel térbeli kódolása: a precessziós frekvencia mágneses térfüggésére épül voxel: térfogatelem pixel: felületelem, elemi képpont Kép B z Elemi 3D képpontok (voxel) definiálása és címezhetősége: grádiens tér segítségével B y RF tekercs Fourier transzformáció B x MRI képalkotás II: színfelbontás (kontraszt) relaxációs idők alapján MRI összefoglalás A szövet B szövet Tranzverzális jelveszteség Zsír Liquor Gerjesztő impulzus B 0 B 0 B 0 Tekercs Rövid T1 Hosszú T1 Idő (ms) B 0 A proton RF hullámot emittál gerjesztést követően. Kriogén mágnes Grádiens tekercs Rádiofrekvenciáns tekercs Vízmolekula Képanalízis (2D-FFT) NMR berendezés T1-súlyozás protonsűrűségsúlyozás T2-súlyozás

9 MRI: képi információ manipulálása I MRI: Non-invazív angiográfia Újraszeletelés merőleges síkban képszelet telített spinek véráram telítetlen spinek Térbeli projekció ( volume rendering ) MRI mozgókép Nagy időfelbontású felvételek alapján Funkcionális MRI (fmri) Élettani folyamattal szinkron felvett Nagy időfelbontású képsorozat Aortabillentyű nyílása-záródása Villogó fény hatása a látókéregre

10 Szuperponált MRI és PET képsorozat PET aktivitás: szemmozgatás során Térbeli rekonstrukció Cary and Michael Huang (