Abszorpciós fotometria

Átírás

1 abszorpció A fény Abszorpciós fotometria Ujfalusi Zoltán PTE ÁOK Biofizikai Intézet január Elektromágneses hullám Transzverzális hullám elektromos térerősségvektor hullámhossz E B x mágneses térerősségvektor x Az elektromos a mágneses térerősség vektorai merőlegesek egymásra, valamint a haladási irányra! James Clerk Maxwell (1864) elméleti szinten igazolta létezüket. Heinrich Rudolf (1888) létezüket kísérletesen bizonyította. Spektroszkópia - Színképvizsgálat Spektro-: görög; jelente kép/szín -szkópia: görög; néz/látás/vizsgálat (nm) Vizsgálatok EM sugarakkal (pl. fény) A spektroszkópia célja Anyag kvalitatív /vagy kvantitatív megismere: Anyagi minőség összetétel: karakterisztikus, ujjlenyomat Szerkezet Az anyag időbeli változásának nyomon követe: (időbontásos spektroszkópia) Anyagi minőségbeli változás (pl. kémiai reakció hatására), Szerkezeti változások követe (gyors kinetikai folyamatok vizsgálatára is alkalmas) Nem látjuk a molekulát, hanem a spektrum (változása) alapján, fizikai ismereteink segítségével következtetünk a szerkezetre (ill. a módosulásra)! 1

2 A spektrum Folytonos emissziós spektrum: Egy hullám, például elektromágneses hullám felhasadása alkotó frekvenciáira. Egy intenzitás-jellegű mennyiség ábrázolva egy energia-jellegű mennyiség függvényében. abszorpció intenzitás, beütszám (pl. radioaktivitás mére), fotonszám, transzmittancia, abszorbancia (extinkció, OD) energia azzal arányos mennyiségek (pl. frekvencia, hullámhossz, hullámszám) Magas hőmérsékleten izzó szilárd folyékony anyagok. Vonalas emissziós spektrum: Meleg gázok emissziós spektruma. Vonalas abszorpciós spektrum: (nm) Hideg gázok abszorpciós spektruma. Fény anyag kölcsönhatása Fontos fizikai mennyiségek, összefüggek Kvantált energiafelvétel (foton) Frekvencia: vagy f (1/s) c f Hullámhossz: (m) Hullámszám: visszaverődhet (reflexió) elnyelődhet (abszorpció) 1 (cm-1) Energia: Atomi rendszerrel (anyaggal) kölcsönható elektromágneses sugárzás: áthaladhat (transzmisszió) E (J) h.f A biológiai hatás létrejöttének feltétele! Einstein: foton (fénykvantum) energiája Extinkc. koeff.: (M-1cm-1 vagy (mg/ml)-1cm-1) Aktin molekula sávos (abszorpciós) spektruma 2.5 molekuláris rendszer 0 S2 Az atomok vonalas a molekulák sávos színképe karakterisztikus (az anyagi minőségtől függ)! S1 h Abszorpció aktin S Excitáció (gerjeszt) Abszorpció (elnyel) A gerjeszt/abszorpció feltétele: Energia 2.0 Abszorbancia vagy OD Jabłonsky-féle termséma DE = h (rezonancia feltétel) A foton energiájától függően létrejöhet: elektromos vibrációs rotációs átmenet ezek keveréke Hullámhossz (nm) 2

3 abszorpció 0Energia Miért sávos a molekulák színképe? molekuláris rendszer Abszorpció S 2 rotációs szintek S 1 vibrációs szintek S 0 vibrációs szintek I = I ( ) x c Lambert-Beer törvény elektromos szintek: S 0, S 1, S 2 ( ) : az extinkciós koefficiens (anyagi minőségtől függ), c: a koncentrációja, x: az optikai úthossz - legyen könnyen érthető - legyen jól mérhető - additív Az abszorpció E OD A = - log (I / I 0 ) = ( ). c. x Számítási feladat I. Határozza meg egy ismeretlen oldat koncentrációját! Adott: E (450) = 0,45 E (450) = (450) c x (450) = 2,25 (mg/ml) -1 cm -1 Optikai úthossz (x) = 1 cm c = E (450) /( (450) x) c =? c = 0,45 / (2,25 (mg/ml) -1 cm -1 1 cm) c = 0,2 mg/ml Miért ( ) nemcsak? (nm) Számítási feladat II/A Határozza meg egy ismeretlen aktin monomer oldat koncentrációját μm-ban (λ= nm-en)! Adott: E (280) = 0,3289 (11x-esen hígított érték!!!) E (290) = 0,1867 (11x-esen hígított érték!!!) (280) = 1,11 ml mg-1 cm-1 (290) = 0,63 ml mg-1 cm-1 Optikai úthossz (x) = 1 cm c =? 0, = 2,0537 E (290) = (290) c x c = E (290) /( (290) x) c = 3,2598 mg/ml Mert az abszorpció függő, így az is az kell hogy legyen! Felhasználva, hogy 1 mg/ml aktin 23 mm anyagmennyiségnek felel meg: c = ~ 75 mm 3

4 Számítási feladat II/B Határozza meg egy ismeretlen aktin monomer oldat koncentrációját μm-ban (λ= nm-en)! Adott: E (280) = 0,3289 (11x-esen hígított érték!!!) E (290) = 0,1867 (11x-esen hígított érték!!!) (280) = 1,11 ml mg-1 cm-1 (290) = 0,63 ml mg-1 cm-1 Optikai úthossz (x) = 1 cm c =? Felhasználva, hogy 1 mg/ml aktin 23 mm anyagmennyiségnek felel meg: 0, = 3,6179 E (280) = (280) c x c = E (280) /( (280) x) c = 3,2598 mg/ml c = ~ 75 mm Transzmisszió I 0 fényforrás T = I / I 0 Általában százalékban (%) adjuk meg. Megjegyz: a transzmittancia (T=I/I 0 ) nem additív! I detektor Számítási feladat III. A) 10% transzmittanciájú anyag abszorbanciája? A = OD = - log (I/I 0 ) = - log (0,1) = 1 Hogyan mérjük az abszorpciót? Egy fotométer működének elméleti sémája Folytonos fényű, Prizma + r vagy optikai rács + r műanyag, üveg, pl.: halogén, kvarc küvettákban R mérete változtatható! deutérium, xenon, stb. lámpa B) 50% transzmittanciájú anyag abszorbanciája? fényforrás monokromátor Minta Detektor 1 A = 0,301 C) Ha a 10% az 1% transzmittanciájú anyagot együtt használjuk, mennyi lesz az eredő transzmittancia abszorbancia? A = 1+2 = 3, T = 0,01 0,1 = 0,001 = 0,1 % Fény Elektromos jel Referencia csatorna Referencia (blank) Időbeli instabilitások (például a lámpáé) kiküszöbölődnek. Detektor 2 Kiértékel (PC) Az alapelv Az emisszió az abszorpció mére Fényforrás PMT Minta Diffrakciós rács emisszió Tér bármely irányából! R Fény detektálás: Elektromágneses sugárzás átalakítása elektromos jellé (feszültségváltozássá). abszorpció Csak lineáris elrendezben! 4

5 abszorpció A fotométer linearitása; stray light effect A fotométer linearitása; stray light effect A probléma oka: nem tökéletesek a monokromátorok! Várható tendencia Meredekség: Optikai rács Második, harmadik, stb. felharmónikusok! koncentráció Kicsi abszorpció mellett Nagy abszorpció mellett I 0 I I 0 I 99% kiválasztott 89% kiválasztott 99% kiválasztott 1% kiválasztott Ezt is érzékeli a detektor!!! Fényszórás Tömény (nagy koncentrációjú) mintáknál már számottevő lehet a stray light effect mellett! Az abszorpciós fotometria alkalmazásai Különböző oldatok (pl. fehérjeoldatok!!!) koncentrációjának meghatározása Időfüggő változások nyomon követe Elektroforézis minták kiértékele 5

6 abszorbancia Abszorpció Fehérjék abszorpciójának mére Az alapvonal (baseline) jelentősége Időfüggő mérek Fehérje PUFFER!!! Anyagi, minőségbeli, szerkezeti változások Követe (pl. kémiai reakciók hatására) idő (s) Elektroforézis minták kiértékelénél Additivitás fehérje Fluoreszcens jelölő * (nm) Kiszámolható a fehérje a jelölő koncentrációja így a jelöli arány. Számítási feladat IV. Határozza meg egy fluoreszcensen (IAEDANS) jelölt ismeretlen aktin monomer oldat koncentrációját μm-ban jelöltségének arányát %- ban kifejezve! Adott: E (290) = 0,269 (21x-esen hígított érték!!!) E (336) = 0,047 (21x-esen hígított érték!!!) (290) = 0,63 ml mg-1 cm-1 (336) = 6100 M-1 cm-1 Optikai úthossz (x) = 1 cm Korrigálni kell a 290 nm-en mért abszorpcióra!!! E (korr.) = E (290) -0,21 E (336) E (korr.) = 0,259 E = ( ) c x c (aktin) = 198,5 mm c (aktin) =? c (IAEDANS) =? Jelöltség =? 81,5 % 0,047 6 c (IAEDANS) = c (IAEDANS) = 161,8 mm 6