Rövid ismertető. Modern mikroszkópiai módszerek. A mikroszkóp. A mikroszkóp. Az optikai mikroszkópia áttekintése

Átírás

1 Rövid ismertető Modern mikroszkópiai módszerek Nyitrai Miklós március 16. A mikroszkópok csoportosítása Alapok, ismeretek A működési elvek Speciális módszerek A mikroszkópia története ld. Pdf. Minél közelebbről vizsgálunk egy objektumot (jelenséget), annál bonyolultabbnak tűnik. Heinrich Weisskopf A mikroszkóp A mikroszkóp (Görögül: mikron = kicsi + szkopein = nézni): egy eszköz, mely megjeleníti a szabadszemmel láthatatlan parányokat. A mikroszkóp A mikroszkópiai alkalmazások célja kicsit szabatosabban. Nagyított, részletgazdag és kontrasztos kép létrehozása. Hogyan osztályozhatjuk a mikroszkópokat? Fény (optikai), pásztázó szondás vagy elektron mikroszkóp. Lehet világos vagy sötét terű mikroszkóp; Felső vagy inverziós mikroszkóp; Átmenő fény, refleksziós vagy fluoreszcens mikroszkóp; Más mikroszkópok; illetve létezik számos speciális optikai mikroszkóp alkalmazás. konvencionális konfokális dekonvolúciós interferencia PM 4Pi 2P 3P 1

2 Geometriai optika A Snellius-Descartes törvény n 1 n 2 A felbontóképesség Két pontnak az a legkisebb távolsága, amit még elkülönülőnek mutat a mikroszkóp. Rayleigh egyenlet: d = 1.22 (λ / 2 NA) α c 1 /n 2 = sinα / sinβ = c 1 /c 2 β d: két pont távolsága λ: a megvilágítás hullámhossza NA: numerikus apertúra Optikailag eltérő sűrűségű közegek Lencsék! Példa: ha NA = 1,4 és λ = 500nm: d = kb. 200 nm Ez az úgynevezett diffrakciós limit. Mélységélesség Nagyítás A mikroszkóp nagyítása: Az a távolságtartomány, amelyen belül az optikai rendszer még éles képet ad. Az okulár nagyítása szorozva az objektív nagyításával. Az okulár általában 10x nagyítást ad. Az objektív lehet például 10x, 20x 40x 60x 100x. Numerikus apertúra Világos és sötét látóterű mikroszkópia Numerikus apertúra egy optikai rendszernek (pl. egy mikroszkóp lencsének) az a legnagyobb nagyító képessége, amellyel még éles képet ad. Számszerűen: NA = n sin ϕ ϕ Világos látóterű Sötét látóterű 2

3 Példák Binokulár A mikroszkópos vizsgálat kényelmesebb és kevésbé fárasztja a szemet, ha a megfigyelésben mindkét szemünket használjuk. Erre a célra szolgál a binokuláris mikroszkóp (nem ugyanaz, mint a sztereomikroszkó!!!), amelynek csak egy objektívje, de két okulárja van. Az objektíven keresztülhaladt sugarakat még a valódi kép keletkezése előtt egy félig áteresztő és félig tükröző prizma két sugárnyalábra bontja, amelyek külön-külön képeket hoznak létre. Ezeket vizsgáljuk az okulárokkal. Sztereomikroszkóp Ha a vizsgált tárgy részeit térben akarjuk vizsgálni, akkor az úgynevezett sztereomikroszkópot használjuk. A sztereomikroszkóp két objektívvel és két okulárral rendelkezik, lényegében két egybeépített mikroszkópból áll. Fluoreszcencia mikroszkópia A képalkotáshoz használt fény fluorofórok emissziójából származik. Ez lehet autofluoreszcencia (klorofill) vagy fluoreszcens festék. Az egyik mikroszkóp kissé jobbról, a másik balról nézve képezi le a tárgyat, és így egymástól kissé különböző képek keletkeznek. Az egyik képet az egyik, a másikat a másik szemmel figyeljük, a tárgyról térbeli képet kapunk. A fluoreszcens mikroszkóp felépítése Fényforrás Gerjesztési diafragma Gerjesztési szűrő Fluoreszcencia mikroszkópiai képek Dikroikus tükör Objektív lencse Okulár vagy kamera Emissziós szűrő A vizsgált mintában az adott fluorofórok eloszlását mutatja meg 2D vagy 3D-ben. Minta 3

4 A háttér fluoreszcencia intenzitása Piros: F-aktin; DAPI: DNS és zöld: membrán fehérje 70. Piros: tubulin; kék: DNS és zöld: aktin. Pl. sejt Piros: mitokondrium; kék: DNS és zöld: aktin. fedőlemez Ifj. Gallyas Ferenc előadása nyomán. Z irányban történő szeparáció gerjesztés Konfokális technika Evaneszcens mező alkalmazása konvencionális konfokális Stb. 2P 3P dekonvolúciós interferencia PM 4Pi gerjesztés (nem-lineáris optika) Klasszikus optika: az anyagok optikai tulajdonságai nem függenek a megvilágítás intenzitásától; Az alapelv: egy foton vs. több foton Egy Két foton: az adott kétszeres gerjesztési hullámhosszon. Nem-lineáris optika: függenek! (ld. még pl. Kerr effektus) fedőlemez 4

5 A jelenség magyarázata Az alkalmazás eredménye Hullámhossz-frekvencia-energiagerjesztési energia S 1 S 1 hf /2 = E/2 hf = E + hf /2 = E/2 S 0 S 0 Konfokális mikroszkópia Jó z irányú felbontást biztosító mikroszkópiai eljárás, ami számítógépes kiértékelés segítségével 3D ábrázolást ad. konvencionális konfokális dekonvolúciós 2P 3P interferencia PM 4Pi A lényeg: a hátsó fókuszsík (a képalkotás helye) a z objektív fókuszsíkjával konjugált viszonyban van (ezért a módszer neve konjugált fokalitás, vagy konfokális mikroszkópia). A konfokális mikroszkóp felépítése x y Fényforrás: lézer A megvilágított térfogat Dikroikus tükör Detektor (PMT) Objektív lencse emisszió Tubus lencse Minta 5

6 A konfokalitás alkalmazásának előnyei Hogyan működik a prizma? Vékony szeletek, azaz kis z tartomány vizsgálata Az eredmények számítógépes kiértékelése, háromdimenziós ábrázolások készítése. Fehér fény prizma A törésmutató hullámhossz függő! Lencsehibák: kromatikus aberráció A lencsék jellemzői, specifikációk Miért alakul ki? Életlenség: 0,3mm Hogyan korrigálható? Egyetlen lencse Ld. még prizma Életlenség: 0,1mm Lencse kromatikus korrekcióval. FLIM A fluoreszcencia élettartam értékeinek 2D vagy 3D ábrázolása. A módszer legfontosabb előnye abból származik, hogy a fluoreszcencia élettartam nem függ a koncentrációtól. FLIM Mi történik, ha a fluorofórok száma megváltozik? A Pl. a fluorofórok egy száma adott eloszlása csökken! (ld. a mintában. photobleaching) Mérhetünk A fluoreszcencia intenzitást intenzitás vagy a élettartamot. koncentráció változásával arányosan csökken, de a fluoreszcencia élettartam NEM változik! 6

7 Hol lehet ez hasznos? Például FRET méréseknél. konvencionális konfokális Komplexkéződés vagy ko-lokalizáció vizsgálata sejtekben. dekonvolúciós interferencia 2P 3P PM 4Pi Nagy felbontású mikroszkópiai módszerek 4Pi mikroszkópia Sokáig úgy tudtuk, hogy a diffrakciós határ miatt nem lehet kb. 200nm-nél jobb felbontást elérni. Mára ez a tétel megdőlt: Kb. 20nm-es felbontású mikroszkópok is léteznek ár!! GFP-vel festett mitokondriumok Saccharomyces cerevisiae-ben. mikroszkópia (Stefan Hell) ( stimulated emission depletion microscopy ) Összefoglalás Alapelvek, típusok, alkalmazások. Konfokális kép kép A humán embrió vese sejtekben jelölt mikrotubulusok. 7