A biológiai anyag vizsgálatának mikroszkópi módszerei

Átírás

1 A biológiai anyag vizsgálatának mikroszkópi módszerei Kis Petik Katalin Semmelweis Egyetem Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet

2 makro Hiszem, ha látom! szem (CT, MRI, UH, PET,...) fénymikroszkópok elektronmikrosz kópok pásztázó módszerek (AFM, STM,...) további trükkös fényt használó módszerek

3 A nano és mikro tartomány méretei molekulák érdekes, de nehezen látható molekulák elektronmikroszkóp 2nm fénymikroszkóp 200nm sejtek, szövetek

4 A fénymikroszkóp egyszerű: nagyító, lupe összetett: objektív és okulár speciális kontraszt: sötétlátótér fáziskontraszt polarizáció fluoreszcencia differenciál interferencia kontraszt modern: optikai szeletelő (konfokális, multifoton) még újabb: szuperfelbontás

5 Antoni van Leeuwenhoek (Thonis Philipszoon) ben egyszerű mikroszkópot készít mikróbákat figyelt meg

6 Ernst Karl Abbe ( ) Fizikus és társadalomreformer is volt. Az optikai eszközök gyártását tudományos alapokra helyezte. a felbontóképesség fizikai határa

7 A fény hullámtermészetének hatása a képre d sin α = k λ

8 Abbe elv A mikroszkópban akkor és csak akkor tudunk feloldani két tárgypontot, ha a diffraktálódot fényhullámból a főmaximumon kívül legalább az első rendben elhajlott fény is részt vesz a képalkotásban. δ = 0,61 λ / (n sinω) Airy korongok point spread function Hallgatólagos feltevések: a minta különböző részeiről egyszerre alkotunk képet; a minta részleteit úgy különböztetjük meg, hogy a róluk jövő fény a létrejövő képben megkülönböztethető képpontokat (foltokat) ad.

9 Összetett mikroszkóp optikai útja nagyított, fordított állású, valós, közbülső kép minta okulár objektív nagyított, egyenes állású, virtuális, kép nagyítás: a kép és a tárgy nagyságának aránya konjugált pontok: P, PI, PII konjugált síkok: Q, QI, QII

10 Végtelenre korrigált optika

11 Köhler megvilágítás megvilágító és képalkotó sugarak kondenzor apertúta: a kondenzor numerikus apertúrája mezőapertúra: a megvilágított terület nagysága

12 Mikroszkóp objektív lencsék

13 Mikroszkóp objektívek felépítése

14 Színkorrekció Korrekció: szférikus aberráció 1 színre 2-3 színre 3-4 színre kromatikus aberráció 2 színre 2-3 színre 4-5 színre nincs nincs igen látómező görbület

15 Plánkorrekció

16 Numerikus apertura

17 A numerikus apertura hatása a PSF-re

18 Sötétlátótér by Michael W. Davidson and The Florida State University.

19 Fáziskontraszt Zernike a fáziskülönbséget láthatóvá tette pozitív negatív humán vvt

20 Polarizációs mikroszkóp az optikai anizotrópiát teszi láthatóvá

21 Differential Interference Contrast (DIC) polarizáció és fáziskontraszt kombinációja HeLa sejtek fáziskontraszt:

22 Fluoreszcencia mikroszkóp HeLasejtek: peroxiszóma EGFP, mitokondrium, magok: Hoechst egér veseszövet molekuláris kifestőkönyv

23 Az ideális fluorofor (festék) kicsi hidrofil megfelelő helyen nyel el és emittál nagy Stokes eltolódás specifikus kötődés (biotin/avidin, His-tag/Ni, antitest/antigén NH2, SH) fényes (abszorpció*fluoreszcencia hatásfok) nem, vagy lassan ég ki nem csinál fotokémiai reakciókat nem pislog

24 Fluoreszcens kvantumpöttyök (a) CdSe-ből ZnS borítással készült knavtumpöttyök fluoreszcenciamikroszkópos képe A kvantumpöttyök mérete határozza meg az emittált fluoreszcencia színét. (b) tíz eltérő méretű, ezeért elérő színben fluoreszkáló CdSe/ZnS kvantumpötty

25 Fluoreszcens kvantumpöttyökkel jelölt rákos daganatok

26 Fluoreszcens fehérjék Aequorea victoria (meduza) Acropora millepora (korall)

27 GFP (Green Fluorescent Protein) évi kémiai Nobel díj Osamu Shimomura a '60 as években izolálta és elkezdte tanulmányozni Martin Chalfie 1994-ben génkifejeződés indikátoraként használta Roger Y. Tsien 1995-ben előállított az első javított változatot

28 A fluoreszcens fehérjék sokfélesége A kép teljes egészében fluoreszcens fehérjéket kifejező baktériumokkal van festve.

29 Fluoreszcens jelölő módszerek párhuzamos alkalmazása Öt különböző módszerrel megfestett HeLa sejtek. A vonal 20 µm hosszú.

30 TIRF csak egy vékony szelet, a minta alja látható

31 FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Az energiatranszfer hatásfoka: KT = (1/τ D) [R0/r]6 AholτD és R0 a festékpárra jellemző állandók, r a festékek közötti távolság.

32 Fluoreszcens indikátorok Ioncsatorna működése a helyi ionkoncentráció mérése alapján Ionkoncentráció és konformációs változások együttes mérése

33 FLIM- fluoreszcencia élettartam kép idő alapú mérés frekvencia alapú mérés

34 Konfokális és multifoton mikroszkóp Z stack

35 Egyfotonos és kétfotonos gerjesztés Miért jobb a kétfoton gerjesztés? -csak a fókuszban gerjeszt (femtoliternyi!) -kevésbé szóródik a hosszabb hullámhosszú gerjesztés (szövetbe bejut) -beépített szelekció, optikai szeletelés, 3D rekonstrukció -a szórt fluoreszcencia fényt is össze lehet gyűjteni (csak a fókuszból származhat) -kevésbé ég a minta - autofluoreszcencia (festék nélkül is látszik) -UV helyett láthatóban gerjeszt - szimultán gerjesztés

36 Élő vesébe látunk! 0 μm >100 μm mm funkciót lehet tanulmányozni IN VIVO

37 GREEN: autofluorescence from NADH RED: 70 kda rhodamin dextrane (blood vessels) YELLOW: Lucifer Yellow (extracellular area) BLUE: Hoechst (nuclei) glomerulus 80 μm deep 20 μm deep 0 μm deep, the capsule

38 Renin termelődés a vesében immunoszupresszáns kezelést követően multifoton mikroszkópia Tac kezelt gyűjtőcsatorna glomerulus + JGA kontroll os: 70kDa rhodamin dextran (ér); zöld: quinacrin (renin); sárga: lucifer yellow (tubulus); kék: Hoechest (mag) CyA kezelt RAS gatlok

39 A festékek eloszlása

40 Véráramlás sebességének mérése line scan 1 ms/line, 0.05 μm/pixel V~ 1-2 mm/s, diameter: 7-11 μm

41 Élőlények fluoreszcencia mikroszkópos tanulmányozása, nanosebészet Caenorhabditis elegans 302 neuronja közül egyetlen idegsejt axonjának átvágása

42 FRAP

43 Korrelációs módszerek FCS diffúziós állandó fényesség-aggregáció

44 Raszter képben is van információ vonal mentén, kör mentén is lehet szkennelni

45 Szuperrezolúció (nanoszkóp) LOKALIZÁCIÓ akár nm pontosan! STORM-stochastic optical reconstruction microscopy véletlenszerűen megvilágított szubpopuláció PALM-Photoactivated localization microscopy fotoaktivált szubpopuláció, mérés, inaktiválás ciklusok STORM, PALM

46 STED (stimulated emission depletion)

47 Irodalomjegyzék ZEISS zeiss-campus.magnet.fsu.edu/ NIKON OLYMPUS LEICA Invitrogen SE Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet biofiz.sote.hu/