MIKROSZKÓPIA. "mikrosz" (kicsiny) "szkopeo" (nézek)

Átírás

1 MIKROSZKÓPIA "mikrosz" (kicsiny) "szkopeo" (nézek)

2 MÉRETTARTOMÁNYOK AZ ÉLŐVILÁGBAN

3 MÉRETTARTOMÁNYOK AZ ÉLŐVILÁGBAN

4 MIKROSZKÓPIA

5 MIKROSZKÓPIA

6 A FÉNY Fény: Az elektromágneses spektrum látható tartománya. Elemi részecskékből (fotonokból) álló, rendezett, több síkban haladó térbeli hullám. Monokromatikus fény: olyan fény, amelyben csak egyetlen hullámhosszúságú sugarak vannak. Összetett fény: Több, különféle hullámhosszúságú fényhullám keveréke. A látható fény hullámhossztartománya nagyjából nm.

7 A FÉNY A fény hullámtani jellemzői: Hullámhossz, (λ): egy adott frekvenciájú hullám ismétlődő egységei (pl. csúcsok) közti távolság. Frekvencia: Az egy másodperc alatti rezgések száma. Amplitúdó: A rezgés hullámok csúcsa és közepe közti távolság, vagyis a hullámok kitérésének mértéke

8 A LÁTHATÓ FÉNY KOMPONENSEI

9 A MIKROSZKÓP FELÉPÍTÉSE okulár objektív makrométer csavar mikrométer csavar tárgyasztal kondenzor diafragma fényforrás

10 A MIKROSZKÓP NAGYÍTÁSA

11 HASZNOSÍTHATÓ-E A MAXIMÁLIS NAGYÍTÁS? A MIKROSZKÓP NAGYÍTÁSA A mikroszkóp nagyítása egyenlő az objektív és okulár nagyításának szorzatával: Okulár: 5-30 x nagyítás Objektív: x nagyítás a színkorrekció jelzése Maximum nagyítás : 3000X az immerzió jelzése az objektív nagyítása mechanikus tubushossz (mm) az objektív frontlencséje a numerikus apertúra értéke javasolt fedőlemez vastagság a különleges rendeltetés jelzése immerziós jelzőcsík

12 A MIKROSZKÓP FELBONTÓKÉPESSÉGE FELBONTÓKÉPESSÉG,( ) : ~0.25 m a legkissebb távolság a minta két, még éppen megkülönböztethető pontja között. A felbontóképesség annál jobb, minél közelebbi pontok különböztethetőek meg egymástól.

13 A MIKROSZKÓP FELBONTÓKÉPESSÉGE A mikroszkóp felbontóképessége, ( ) : ( ) = 2 A fényhullám hossz numerikus appertura objektív tárgy A = n sinα n: a tárgyat takaró fedőlemez és a frontlencse közötti közeg törésmutatója. n értéke levegőre n=1, desztillált vízre n=1,33, cédrusolajra n=1,51. α: az optikai főtengely és a legszélső fénysugár által bezárt szög (az objektív nyílásszögének a fele)

14 FELBONTÓKÉPESSÉG JAVÍTÁSI LEHETŐSÉGEI (i)a számlálóban szereplő érték csökkentése, vagyis rövidebb hullámhosszúságú fény alkalmazása. Ultraibolya fény alkalmazásával a felbontókpesség akár 0,1 μm-re csökkenthető, ám mivel költséges kvarc lencséket kell alkalmazni és olyan detektort, amely érzékeli az ultraibolya fényt, az ultraibolyafénymikroszkópot ritkán használják.

15 FELBONTÓKÉPESSÉG JAVÍTÁSI LEHETŐSÉGEI (ii) A nevező, vagyis a numerikus apertúra értékének növelése. n növelése: A fedőlemez és a frontlencse közé a levegőnél nagyobb törésmutatójú anyagot cseppentünk, és a frontlencsét a folyadékcseppbe merítjük. Ezeket a lencséket (leggyakrabban a 100-szoros nagyítású objektíveket), immerziós (bemerülő) objektíveknek nevezzük. Az immerziós folyadék leggyakrabban cédrusolaj. Az olajos objektívek az ún. olajimmerziós, vagy más néven homogén immerziós objektívek (jelük HI). Ha az objektíven a WI jel van, az objektív és a fedőlemez közé desztillált vizet kell csöppenteni. Cédrus olaj (n=1,51) használata esetén a numerikus apertúra értéke 1,43 (sin72 =0,95; 0,95x1,51= 1,43, vagyis ekkor a fénymikroszkóp felbontása 0,28 μm). növelése: A lencse fél nyílásszögét hozzávetőleg 72 -ig lehet fokozni, mert a nagyobb beesési szöggel érkező fénysugarak már teljes visszaverődést szenvednek. Minthogy a levegő törésmutatója 1, a legjobb felbontású száraz objektívek numerikus apertúrája 0,95.

16 MIKROSZKÓPOS MÉRETMEGHATÁROZÁS objektív mikrométer okulár mikrométer

17 MIKROSZKÓPOS MÉRETMEGHATÁROZÁS hajszál objektív mikrométer skála okulár mikrométer skála mikrométer okulár mikrométer skála

18 Speciális mikroszkópos vizsgálati módszerek 1. Fáziskontraszt mikroszkópia 2. Fluoreszcens mikroszkópia 3. Pásztázó lézer konfokális mikroszkópia 4. Elektron mikroszkópia

19 Fáziskontraszt mikroszkópia A biológiai minták jelentős része átlátszó, ha hagyományos fénymikroszkóppal vizsgáljuk. A fáziskontraszt mikroszkóp képes a kontraszt növelésére festetlen minták esetében, a felbontóképesség jelentős csökkentése nélkül. A fáziskontraszt mikroszkópot elsősorban élő, festetlen minták vizsgálatára használjuk. Fritz Zernike 1953-ban Nobel díjat kapott a fázis kontraszt mikroszkóp feltalálásáért. A minta optikailag sűrűbb részén áthaladó, fáziskésést szenvedett, elhajlott fénysugarak útja elválik a mintán elhajlás nélkül áthaladó fénysugarakétól, melyeket az objektív fázislemeze felgyorsít. A két fénysugárpopuláció interferenciája kontrasztos képet eredményez, ahol az optikailag sűrűbb részek sötétebbek. Élő sejtek hagyományos fény (a) és fáziskontraszt mikroszkóppal (b) vizsgálva

20 Fázis kontraszt mikroszkópia fázislemez fázisgyűrű

21 Fázis kontraszt mikroszkópia fázislemez baktérium a minta által megtört fénysugarak 1/4 fáziskésést szenvednek a minta által megtört fénysugarak 1/2 fáziskésést szenvednek kioltás a nem érzékelhető fáziskülönbségek szemmel látható amplitúdó változássá alakulnak

22 Fluoreszcens mikroszkópia/ Pásztázó lézer konfokális mikroszkópia ultraibolya Látható fény infravörös infravörös Hullámhossz (nanométer)

23 Megtermékenyítés: spermium aszter, hím és női pronukleusz Mikrotubulus DNS Centroszóma

24 Transzfektált sejtkultúra DNS microtubulus aktin

25 Mikroszkópia: múlt és jelen vékonybél keresztmetszet, haematoxilin/eozin festés vékonybél keresztmetszet, immunofluoreszcens festés

26 Mikroszkópia: múlt és jelen here keresztmetszet, haematoxilin/eozin festés here keresztmetszet, immunofluoreszcens festés

27 Fluoreszcencia. Fluoreszcencia -egy atom vagy molekula külső sugárzás hatására átmenetileg gerjesztett állapotba kerül, majd alacsonyabb energiájú (nagyobb hullámhosszú) fotont bocsájt ki (emittál). A fluoreszcens abszorpció és emisszió egy nanoszekundumon belül játszódik le.

28 Fluoreszcens Mikroszkópia A fluoreszcens mikroszkópia napjaink leggyorsabban fejlődő mikroszkópiás technikája, mind az orvostudomány, mind a biológiai kutatások nélkülözhetetlen eszköze. Legfontosabb alkalmazási területe a különböző makromolekulák térbeli és időbeli elhelyezkedésének vizsgálata sejt/szövet szinten. Használják még többek között fehérje interakciók vizsgálatára, de a sejten belüli ph és ionkoncentrációk meghatározására is.

29 A fluoreszcens mikroszkóp felépítése

30 A fluoreszcens filter kocka felépítése Gerjesztő szűrő (exciter filter): a higanygőz/xenon lámpa fényének csak meghatározott tartományát engedi a vizgálandó mintára. Határoló szűrő (barrier filter): csak a megfelelő hullámhosszú emittált fénysugarakat engedi át a detektor felé, a gerjesztő sugarakat kiszűri. Dikroikus tükör (dichroic mirror): visszaveri a gerjesztő, átengedi az emittált fénysugarakat.

31 Fluorokrómok Fluorokróm Természetes vagy szintetikus, fluoreszcenciára képes molekula. A fluorokrómok delokalizált elektronrendszere felelős a specifikus abszorbcióért és emisszióért.

32 Fluorokrómok

33 Fluorokrómok Bovine pulmonary artery endothelial cells visualized using components of the SelectFX Nuclear Labeling Kit and Alexa Fluor phalloidin conjugates. Nuclei and F-actin were stained, respectively, with (top left) DAPI and Alexa Fluor 680 phalloidin, (top right) SYTOX Green dye and Alexa Fluor 568 phalloidin, (bottom left) 7-AAD and Alexa Fluor 488 phalloidin, and (bottom right) TO-PRO-3 dye and Alexa Fluor 350 phalloidin.

34 Sejtorganellum próbák: Sejtorganellum/DNS/Ca 2+ próbák Mitokondrium: MitoTracker and MitoFluor Lizoszóma: LysoTracker and LysoSensor Golgi apparátus: BODIPY Endoplazmatikus retikulum: DiOC, Blue-White DPX DNS: Acridine orange, Propidium iodide, DAPI, Hoechst Ca 2+ : fura-2 and indo-1, fluo-3, fura red endotél sejt. mitochondrium vörös, peroxiszóma zöld, sejtmag kék.

35 Immunofluoreszcens Mikroszkópia

36 Immunofluoreszcens Mikroszkópia

37 Immunofluoreszcens Mikroszkópia MT DNS CS

38 Fluoreszcens fehérjék Green Fluorescent Protein (GFP) - Medúzából származó fluoreszcens fehérje. Használjuk fehérjék elhelyezkedésének, koncentrációjának, kölcsönhatásainak és dinamikájának meghatározására élő sejtekben/szövetekben. Gyakorlatilag bármely fehérjét nyomon tudunk követni ha hozzá GFP-t fuzionáltatunk. Genetikailag módosított GFP variánsok, mint YFP (sárga), cián (CFP) léteznek a megfelelő irányba eltolt emissziós spektrummal (lásd FRET). DsRed -Vörösben emittáló fluoreszcens fehérje

39 Fluorescent Proteins Tubulin-GFP

40 GFP-FÚZIÓS FEHÉRJÉK izsgálandó gén plazmid GFP génnel transzfekció fúziós fehérje zöld fényt bocsájt ki kék gerjesztőfény hatására, a fehérjét nyomonkövethhe tjük élő sejtben GFP transzkripció, transzláció

41 Pásztázó lézer konfokális mikroszkópia A konfokális mikroszkóp segítségével a hagyományos fluoreszcens mikroszkópnál mélyebben lehet behatolni a sejtekbe/szövetekbe. A mintát lézer gerjeszti pontonkként, x-y irányban pásztázva. Az emittált fotonokat egy fotoelektron sokszorozó detektálja. A mintából vékony optikai metszetek sorozatát készítjük, ugyanis a detektor előtti csapnyílások kiszűrik a más fókuszsíkokból jövő zavaró fluoreszcenciát. Az optikai metszetekből a vizsgált minta háromdimenziós szerkezete számítógéppel meghatározható. a konfokális mikroszkóp fényútja lézer fókuszban levő emittált sugár minta fotoelektron sokszorozó detektor detektor csapnyílás fókuszon kívüli emittált sugarak dikroikus tükör objektív gerjesztő sugár fókuszsíkok

42 Pásztázó lézer konfokális mikroszkóp 75 millió Ft

43 Fényforrások fluoreszcens/konfokális mikroszkópiához

44 Fluoreszcens és konfokális képminőség összehasonlítása

45 Z-szeletelés

46 Z-szeletelés Drosophila Egg Chamber

47 Z-szeletelés Drosophila Egg Chambers

48 3D Rekonstrukció Z-szeletelés után a mikroszkóphoz kapcsolt számítógép segítségével a minta térbeli szerkezete modellezhető, a minta térbeli képét bármilyen irányből vizsgálhatjuk.

49 3D Rekonstrukció Drosophila Egg Chamber

50 3D Rekonstrukció Drosophila Egg Chambers

51 3D Rekonstrukció Drosophila Egg Chamber

52 3D Rekonstrukció Tubulin-GFP, Histon-RFP Drosophila mitotic spindle

53 4D képalkotás A konfokális mikroszkópot be lehet programozni hogy tetszőleges időnként készítsen képeket az élő mintáról. Az igy készült képekből mozi fájlokat készítünk.

54 4D képalkotás Tubulin-GFP

55 4D képalkotás Tubulin-GFP, Histon-RFP Drosophila embryonic divisions

56 4D képalkotás Tubulin-GFP, Histon-RFP Drosophila embryonic divisions

57 FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer Elsősorban fehérje-fehérje interakciók valós idejű megfigyelésére alkalmas módszer. Mindkét interakció gyanús fehérjéhez fluorokrómot kapcsolunk. Leggyakrabban CFP-t az egyikhez, YFP-t a másikhoz. Ha van interakció CFP-t gerjesztve a YFP emisszió mértéke nő meg, ha nincs, a CFP emisszió nő. Lásd ábra.

58 FRET: fluorescence resonance energy transfer CFP CFP YFP YFP

59 Fluoreszcens in situ Hibridizáció fluoreszcensen jelölt DNS próbák hibridizálása genomiális DNS- hez, szekvenciák lokalizációjára, génátrendeződések vizsgálatára használjuk. Orvosi gyakorlatban a kromoszómaszám rendellenességek (és egyéb kromoszóma mutációk) praenatalis diagnózisa a legfontosabb felhasználási területe. FISH

60 ELEKTRON MIKROSZKÓPIA Elektron-sugár forrás (Elektron ágyú) Filament Melegítés (500 C) e Wehnelt sapka (negatív potenciál) Töltés kollektor e - e - e Anód (positív potenciál)

61 Transzmissziós electron mikroszkóp (TEM) Elektorn sugár Kondenzátor lencsék Kondenzátor apertura Minta OBJEKTÍV Objektív apertura Közbeiktatott lencsék PROJEKTOR Detektor

62 Transzmissziós electron mikroszkóp (TEM)

63 Pásztázó Elektron Mikroszkóp (SEM) Elektorn sugár Első kondenzátor lencse Kondenzátor appertúra Második kondenzátor lencse Objectív apertúra Pásztázó teketrcs OBJEKTÍV MINTA Visszavert elektronok Erősítő/Detektor Másodlagos elektronok

64 Pásztázó Elektron Mikroszkóp (SEM)