2008 Small World contest -18th Prize - Dr. Tamily Weissman (Harvard University - Cambridge, Massachusetts, United States) Specimen: Brainbow

Átírás

1 2008 Small World contest -18th Prize - Dr. Tamily Weissman (Harvard University - Cambridge, Massachusetts, United States) Specimen: Brainbow transgenic mouse hippocampus (40x) Technique: Confocal

2 Mikroszkóp - mikroszkópia görögül: mikron = kicsi + szkopein = nézni MIKROSZKÓP olyan eszköz, mely megjeleníti az emberi szem számára láthatatlan parányokat MIKROSZKÓPIA a szabad szemmel láthatatlan parányok mikroszkóppal való tanulmányozásának tudománya

3 Képalkotás 1. NAGYÍTÁS 2. FELBONTÁS 3. KONTRASZT

4 Fénymikroszkópia A képalkotás során közönséges fényt használ a tárgy megvilágítására.

5 A fénymikroszkóp képalkotása - Alapelvek TÁRGY KÉP1 (valódi, nagyított, fordított állású) KÉP2 (látszólagos, nagyított, egyenes állású) TÁRGY KÉP2 (látszólagos, nagyított, fordított állású)

6 1. Nagyítás OBJEKTÍV: N objektív = OKULÁR: N okulár = 5 30 MIKROSZKÓP: N mikroszkóp = N objektív x N okulár

7 2. Felbontóképesség az a legkisebb távolság (d), amelyre lévő két pont (tárgypont) képe még megkülönböztethető egymástól RAYLEIGH EGYENLET XY irányban a minta síkjában d x y, 0.61 NA Z irányban optikai tengely mentén d z 2 2 NA d: két pont távolsága λ: a megvilágítás hullámhossza NA: numerikus apertúra 1/d: a mikroszkóp feloldóképessége

8 2. Felbontóképesség - Hullámhossz d 0.61 NA d z 2 2 NA NA = 1.4 HULLÁMHOSSZ nm FELBONTÁS - XY nm FELBONTÁS - Z nm növelésével a felbontóképesség csökken

9 2. Felbontóképesség - Numerikus apertúra egy optikai rendszernek (pl. egy mikroszkóp lencsének) az a legnagyobb nagyító képessége, amellyel még éles képet ad. az optikai lencserendszerek fénygyűjtő képességének egység nélküli mérőszáma, mely meghatározza a felbontóképességet és a mélységélességet. NA nsin n: a tárgy és az objektív közötti anyag törésmutatója μ: az objektív félnyílásszöge NA =

10 2. Felbontóképesség - Airy korong a tárgy egyes pontjairól érkező fénysugarak az objektív nyílásán elhajlást szenvednek a képpontok helyett koncentrikus körök formájában megjelenő erősítési és kioltási helyek sorozata alakul ki Egyetlen tárgypont elhajlási képe: AIRY KORONG (George Biddel Airy ) TÁRGY KÉP erősítés kioltás

11 3. Kontraszt A minta optikai inhomogenitása miatt (törésmutató, alak,..) a rajta áthaladó a fénysugarak sajátságai (irány, sebesség, fázis, ) megváltozhatnak KONTRASZT

12 Fluoreszcencia mikroszkópia A képalkotáshoz használt fény fluorofórok emissziójából származik. A mintának a megvilágító fény által kiváltott fluoreszcenciáját képezzük le.

13 Fluorofórok BELSŐ (INTRINSIC) FLUORESZCENCIA klorofil KÜLSŐ (EXTRINSIC) FLUORESZCENCIA fluoreszcens molekulák kvantum gyöngy (d = 2-10 nm, atom) fehérje (GFP) (d = 10 nm, 26 kda) kis molekula (d = 1 nm, 20 atom)

14 Mikroszkóp

15 Mikroszkóp GERJESZTÉS SZEMLENCSE MINTA DETEKTOR OBJEKTÍV SZŰRŐK TÜKRÖK

16 Gerjesztés: Lámpák, lézerek LÁMPA: xenon ív, higanygőz LÉZER, LED

17 Szűrők: gerjesztési/emissziós egy meghatározott hullámhossztartomány kiválasztása

18 Dikroikus tükör egy meghatározott hullámhossztartományban visszaveri a fényt, a többi hullámhossztartományon átenged (NYALÁBOSZTÓ)

19 Szűrők + tükrök EMISSZIÓ emissziós szűrő dikroikus tükör GERJESZTÉS szűrő kocka gerjesztési szűrő

20 Objektív nagyítás fedőlemez tárgylemez típus immerzió immerzió típusa típusa NA fedőlemez típusa nagyítás színkód munka távolság

21 Detektorok foton elektromos jel FOTOELEKTRON SOKSZOROZÓ FOTODIÓDA CCD KAMERA (charged coupled device)

22 Fluoreszcencia mikroszkópia Probléma 1 emisszió m gerjesztés HÁTTÉRFLUORESZCENCIA!!! Z IRÁNYÚ FELBONTÁS JAVÍTÁSA konfokális technika evaneszcens mező alkalmazása több foton gerjesztés

23 Konfokális mikroszkópia

24 Konfokális mikroszkópia - Alapelvek KONJUGÁLT FOKALITÁS : KONFOKÁLIS detektor emisszió fókuszponton kívüli apertúra fókuszpontból gerjesztő lézer gerjesztés apertúra fókuszsíkok

25 Konfokális mikroszkópia

26 Konfokális mikroszkópia felbontás XY: 200 nm Z :400 nm

27 TIRFM Total Internal Reflection Microscopy Teljes belső visszaverődéses fluoreszcencia mikroszkópia

28 TIRFM - Alapelvekc TELJES BELSŐ VISSZAVERŐDÉS teljes belső visszaverődés sin sin n 2 n 1 n n kritikus o megtört

29 TIRFM - Alapelvek EVANESZCENS MEZŐ I( z) I0 exp( z / d) [z], nm I(z) %-ban

30 TIRFM - Alapelvek nagy NA immerziós olaj (n) a gerjesztő nyaláb tengelyen kívüli helyzete

31 TIRFM

32 TIRFM felbontás XY: 200 nm Z :100 nm

33 Több-foton gerjesztéses mikroszkópia

34 Több-foton gerjesztéses mikroszkópia - Alapelvek Nemlineáris optika E hc Jablonski diagram 1 1 t s LÉZER!! impulzuslézer

35 Több-foton gerjesztéses mikroszkópia

36 Fluoreszcencia mikroszkópia Probléma 2 FELOLDÓKÉPESSÉG RAYLEIGH EGYENLET d 0.61 NA HULLÁMHOSSZ nm FELBONTÁS - XY nm XY FELBONTÁS JAVÍTÁSA fizikai módon matematikai módon

37 STED Stimulated Emission Depletion Microscopy Fluoreszcencia emisszió stimulált gyengítésén alapuló mikroszkópia

38 STED - Alapelvek Fluoreszcencia emisszió stimulált gyengítése gerjesztés fluoreszcencia nem lineáris le-gerjesztés alapállapot - nonfluoreszcens maradék fluoreszcencia

39 STED - Alapelvek fázislemez gyengítő lézer STED lézer gerjesztés gyengítés red shift dikroikus tükrök gerjesztő lézer objektív minta széleslátóterű STED

40 STED Aktin filamentumok Elise Stanley, Division of Genetics & Development, Toronto Western Research Institute (TWRI), Canada

41 STED felbontás XY: nm Z :100 nm

42 SIM Structured Illumination Microscopy Struktúrált megvilágítás mikroszkópia

43 SIM - Alapelvek rács forgatása + képkészítés képanalízis fontos: rács geometriája forgatások száma

44 SIM felbontás XY: 100 nm Z : nm

45 FLIM Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy FADIM Fluorescence Anisotropy Decay Imaging Microscopy Fluoreszcencia élettartam/anizotrópia mikroszkópia

46 FLIM - FADIM

47 FRAP Fluorescence Recovery After Photobleacing Fluoreszcencia intenzitás visszatérése kioltás után

48 FRAP Fluoreszcencia intenzitás intenzív lézerimpulzus kioltás kinetikai analízis fluoreszcencia intenzitás visszatérésének sebessége mennyisége kioltás visszatérés mobilis 50% immobilis idő (t)

49 Elektronmikroszkópia (EM) Ernst Ruska Krio-elektrontomográfia (krio ET)

50 Elektronmikroszkópia (EM) A képalkotáshoz elektronnyalábot használ. optikai em hullámhossz nm felbontás ~ nagyítás 200 nm 2000 x 0.2 nm (50 pm) x ( x) Az 1933-ban Ernst Ruska által készített elektronmikroszkóp

51 Elektronmikroszkópia (EM) TRANSZMISSZIÓS ELEKTRONMIKROSZKÓP (TEM) a tárgy megfigyelését elektronsugárral való átvilágításban végzi PÁSZTÁZÓ ELEKTRONMIKROSZKÓP (SEM) a visszavert elektronok segítségével állít elő képet a tárgy felületéről

52 Elektronmikroszkópia (EM) nagyfeszültség: kV elektronágyú FORRÁS elektron nyaláb vákuum: Pa OPTIKAI KOMPONENSEK MINTA OPTIKAI KOMPONENSEK LENCSÉK elektromágnes elektrosztatikus mező fixált minta: negatív festés (urán acetát), folyékony nitrogén LENCSÉK elektromágnes elektrosztatikus mező DETEKTOR

53 Krio-elektrontomográfia (krio-et) 2D helyett 3D Plasmodium berghei HIV vírus sejt F-aktin nukleáris pórus komplex

54 AFM Atomerő mikroszkópia Gerd Binnig

55 AFM POZÍCIÓ ÉRZÉKENY DETEKTOR kvadráns dióda LÉZER RUGÓLAPKA MINTA z x y

56 AFM B16 egér melanoma sejt

57 További érdekességek 2010 Small World contest - 7th Prize - Mr. Yongli Shan (UTSW - Dallas, Texas, USA) Specimen: Endothelia Cell attached to synthetic microfibers (2500x) Technique: Epifluorescence, Confocal