OLYMPUS Hungary Kft. Mikroszkóp Divízió. A mikroszkópia alapjai

Átírás

1 OLYMPUS Hungary Kft. Mikroszkóp Divízió A mikroszkópia alapjai Előadó: Vida László Krisztián Laszlo.Vida@olympus-europa.com

2 A fénymikroszkópia alapjai Tartalom: A színek jelentése a mikroszkópiában és a képalkotásban Optikai terminológia A fénymikroszkópok felépítése Napjaink mikroszkópjai Kontrasztjavító eljárások a mikroszkópiában Széles látóterű fluoreszcens mikroszkópia Detektálási technológiák (digitális képalkotás) Fejlett képalkotó technológiák és műszaki megoldások

3 A színek jelentése a mikroszkópiában és a képalkotásban A fény meghatározott amplitúdójú ( fényerő) és hullámhosszúságú ( szín) elektromágneses sugárzás A szín egyedüli forrása a fény, egyetlen határozott szín általában több különböző eredőjeként áll elő - ebből áll össze a látható spektrum. Az emberi szem a kb. 400nm és 700 nm közötti hullámhosszú fényre érzékeny (az ezen tartományban keletkező színeket érzékeli)

4 Optikai terminológia Mezőszám (Field Number, FN): az okulár diafragma mérete mm-ben (a minta képalkotási területe, növelése ld. MIA / panoráma); a gyakorlatban: FoV = OkulárFN / objektív nagyítás (mm) Munkatávolság (Working Distance, WD): az objektív frontlencséje és a minta (vagy a fedőlemez) felülete között távolság fókuszban lévő minta esetén Parfokális távolság (Parfocal Distance, PD): az objektív foglalatának síkja és a minta közötti távolság (Olympus UIS2 optika esetén 45mm) Teljes nagyítás a binokuláris tubusban: M BI = M OB x M OK (x M MagChanger ) Teljes nagyítás a monitoron: M VIDEO = M OB x M AD x D Monitor / D CCD

5 Optikai terminológia Numerikus apertúra (Numerical Aperture, NA): NA = n x sinθ n: törésmutató, θ :félszög; Levegő: n = 1, olaj: n = Üres nagyítás: kb. >1000 x NA

6 Optikai terminológia Laterális felbontóképesség (Lateral Resolution): az objektív azon képessége, amilyen mértékben meg tud különbözteti egymástól két vonalat vagy pontot egy objektumon Rovátka (line grating - B/W vonalak váltakozva) mintát feltételezve d min a még éppen feloldható távolság a hagyományos széleslátóterű mikroszkópiában, ahol λ 0 az alkalmazott megvilágítás (fény) hullámhossza (látható fényre 0.55µm) NA obj az objektív numerikus apertúrája NA kond a kondenzor numerikus apertúrája

7 Optikai terminológia Pontszerű mintát feltételezve a formula: ahol r Airy az Airy diffrakciós kép központi diszkje körüli első sötét gyűrű sugara (NA obj = NA cond ) Ez abban az esetben áll fenn, ha a két azonos intenzitású különálló pontszerű fényforrás képének kontrasztja 74%, valamit teljesülnek a Rayleigh kritériumok: A két pont inkoherens A két pont intenzitása azonos A 74% kontraszt az emberi szem felbontóképességének határa A laterális felbontás e képlete a diffrakció-elméletből származik.

8 Mitől homályos a kép? minta Airy korongok (diffrakció) homályos kép

9 Optikai terminológia Elérhető valós felbontóképesség napjainkban: Fénymikroszkóp: kb. 0.24µm = 240nm (PlanApo100xO/1.4, 550nm) STED (Stimulated Emission Depletion): kb. 30nm Pásztázó elektronmikroszkóp: kb. 2.3nm Transzmissziós elektronmikroszkóp: kb. 0.2nm Pásztázó szondamikroszkóp: szub-ångström (1Å = m)

10 Optikai terminológia Mélységélesség (Focal Depth of Microscope): a minta azon rétegvastagsága, ami egyidejűleg fókuszban van, a fókuszpozíciótól függetlenül. Mivel az emberi szem fókuszálási képessége egyénenként változó, ezért a mélységélesség érzékelésének képessége is eltérő. Jelenleg a gyakorlatban a Berek formulát használják, mert az ezzel kapott mélységélesség értéke gyakran egybeesik a kísérletekben tapasztalt mélységélességgel. ω - az emberi szem felbontóképessége (0.5 foknál) M teljes nagyítás λ 0.55µm

11 Optikai terminológia Ideális kép + aberrációk = valódi kép Ideális kép: pont leképezése pont Valódi kép: pont leképezése Airy korongok (diffrakciós maximumok és minimumok váltakozva)

12 Optikai terminológia Szférikus aberráció (gömbi eltérés, nyíláshiba): Egyszínű sugarak esetén a lencse külső zónáinak gyújtótávolsága kisebb, mint a belsőké az optikai tengelyen lévő pont képe nagy nyílásszögű sugárnyaláb esetén nem pontszerű, hanem gyújtófelület (diakausztika) Megoldás: rekeszelés (diafragma) vagy összetett lencse

13 Optikai terminológia Kóma (üstököshiba): Az optikai tengelytől távoli tárgypont képe pont helyett fényfolt, vagy csak a szélső sugarak használata esetén (diafragma) szimmetrikus görbe Megoldás: a szélső sugarak rekeszelése és a szinuszfeltételnek (Abbe, 1873) eleget tevő lencserendszer alkalmazása: ( n sin(u) / n sin(u ) ) = y / y, illetve sin(u) / sin(u ) = y / y, ha n = n, azaz a nagyításra vonatkozó y / y = k / t összefüggésnek akkor is igaznak kell maradnia, ha a tárgy- és képtávolságot nem a főtengelyen, hanem a szélső sugarak mentén mérjük aplanatikus leképezés

14 Optikai terminológia Asztigmatizmus: Ferdén beeső keskeny nyaláb esetén az sehol nem húzódik össze ponttá, hanem egy helyen aránylag éles, rövid vonallá, távolabb pedig egy másik vonallá. E két képvonal (fókuszvonal) egyike a meridiánsíkban, másik pedig a szagittális síkban van. Mivel a lencse két síkkal való metszetét nem egyforma görbületű vonalak határolják, így a két sík sugarai nem egy pontban egyesülnek asztigmiás különbség.

15 Optikai terminológia Képgörbület (képmezőhajlás) Az asztigmatizmussal szorosan összefüggő hiba, amely miatt a lencse főtengelyére merőleges sík tárgy viszonylag éles képe nem sík, hanem görbe felület mentén keletkezik Megoldás: összetett (anasztigmát) lencserendszer az asztigmatizmus és képgörbület kiküszöbölésére

16 Optikai terminológia Geometriai torzítás (disztorzió) nem a kép élességére, hanem annak az eredeti tárgyhoz való geometriai hasonlóságára vonatkozik. Ennek oka, hogy a nagyítás a kép nem minden részén ugyanakkora hordó (itt a nagyítás a széleken kisebb, mint középen), illetve párna (itt a nagyítás a széleken nagyobb, mint középen) alakú torzítás. Mértéke függ a lencse alakjától és a diafragmák helyétől és nyílásától Megoldás: ortoszkopikus objektív (két meniszkuszlencse között egy diafragma)

17 Optikai terminológia Tengelymenti (longitudinális v. axiális) színi hiba (kromatikus aberráció): a lencsék törésmutatója a fény hullámhosszától függ, általában a vöröstől az ibolyáig csökken, azaz a fókusztávolság hullámhossz-függő. Mivel a gyújtótávolság nem csak a kép helyét, hanem a nagyítást is befolyásolja, ezért a színi eltérés egyrészt a képhely, másrészt a képnagyság színi hibájában nyilvánul meg. Megoldás: akromát lencse / apokromát lencse

18 Optikai terminológia Tengelyre merőleges (laterális vagy transzverzális) színi hiba A nagyítás hullámhossz-függő

19 Optikai terminológia A színi hiba korrekciói

20 Napjaink fénymikroszkópjai

21 Upright mikroszkóp felépítése

22 Inverz mikroszkóp felépítése

23 Sztereó mikroszkóp felépítése

24 Makroszkóp felépítése SZX MVX NA small large

25 Kontrasztjavító eljárások a mikroszkópiában Világoslátótér (BF) Sötétlátótér (DF) Polarizáció (POL) Fáziskontraszt (PH) Relief kontraszt (RC) / Hoffmann modulációs kontraszt Nomarski Differenciál Interferencia Kontraszt (DIC) Fluoreszcencia (FLUO) Teljes belső visszaverődés (TIRFM)

26 Világoslátótér

27 Sötétlátótér Sötétlátóterű-/Ultramikroszkóp Speciális kondenzorral a megvilágító fénykúp központi sugarát kitakarjuk, ezzel körkörösen oldalról világítva meg a mintát A képalkotásban csak az indirekt fénysugarak vesznek részt, amik a minta részletein szóródva jutnak az objektívbe Alkalmas kis fényszóró objektumok mozgásának vizsgálatára

28 Világoslátótér vs. Sötétlátótér

29 Polarizáció Polarizációs mikroszkóp Polarizátor ( lineárisan poláros fény) + rá 90 analizátor Ideális pozíció: a polarizáció síkja és a tárgy optikai tengelye által bezárt szög 45 Az izotróp részen áthaladva a polarizáció nem változik, viszont az anizotróp részen elliptikusan poláros fénnyé alakul Az izotróp részeken áthaladó fény (az analizátor után) nem jut az objektívbe, de az elliptikusan poláros fény igen csak a kettősen törő tárgyrészlet látszik

30 Polarizáció A szín oka: az elliptikusan poláros fény esetében az ellipszis két tengelyének iránya és aránya hullámhossz-függő Adott hullámhosszon lehet az ellipszis tengelye 0, ekkor a kilépő fény lineárisan poláros, a polarizáció iránya az analizátor polarizációs irányára merőleges az analizátor kioltja a fényt az adott hullámhosszon: az adott tárgyrészlet színeként a kioltott sugarak kiegészítő színét látjuk Alkalmas kettősen törő (t.i. bennük a fényre vonatkozó törésmutató (ill. terjedési sebesség) nem irányfüggetlen) anyagok vizsgálatára az optikai anizotrópia mindig bizonyos rendezettséget mutató belső szerkezet következménye Pl. kristályok és folyadékkristályos struktúrák (sejtmembrán, polimerek, harántcsíkolt izmok, stb.), vagy áramoltatással rendezett fonalszerű makromolekulák

31 Fáziskontraszt Frits Zernike ( , holland fizikus) Kontrasztnövelés átlátszó biológiai mintákban (pl. sejtek, szövetek, mikroorganizmusok) A módszer a fény fázisában jelentkező (szabad szemmel nem látható) különbségeket alakítja át intenzitásbeli különbségekké

32 Fáziskontraszt A nulladrendű (főmaximum) nyaláb amplitúdóját lecsökkentik, fázisát pedig késleltetik vagy siettetik 90 -kal A kondenzorban gyűrűs üveglap világító kúppalástot formál az objektív hátsó fókuszsíkjában gyűrű alakú diffrakciós maximumok láthatóak Az objektív hátsó fókuszsíkjára gyűrű alakú fázislemez-réteg van párologtatva, amely egyrészt elnyeli a direkt fény egy részét, másrészt ±90 -os fáziseltolást végez (+: negatív, -: pozitív) Pozitív kontraszt esetén jelentősen csökken a nagyobb törésmutatójú pontok intenzitása a környezetükkel azonos törésmutatójú pontokéhoz képest A környezetüknél kisebb törésmutatójú pontokon fázissietés következik be, amelyet a fázisgyűrű kompenzál, így az ott áthaladó hullámok a szórt hullámokkal kb. azonos fázisban érkeznek, interferenciájuk erősítést eredményez e pontok képe világosabb

33 forgatható polarizátor Relief kontraszt 1% kondenzor minta 15 % objektív modulátor

34 Nomarski Differential Interference Contrast (DIC)

35 Nomarski Differential Interference Contrast (DIC) A hagyományos oblique és relief megvilágításra épülő kontrasztjavító eljárásokkal szemben a DIC csak a fókuszsíkban (DoF) növeli a kontrasztot, így a fókusz állításával optikailag szeletelhető a minta. IR fény használata esetén (775nm vagy 900nm) akár >100µm mélyen is bele lehet látni a vastag mintába (pl. neurológiai kutatások, IRCCD!) A Nomarski DIC a különböző törésmutatójú anyagokon áthaladó fényben keletkező fáziseltérésekből állít elő javított kontrasztot Polarizátor lineárisan poláros fény Wollaston prizma ordinárius és extraordinárius nyaláb (közöttük 90 fáziseltolás) külön úton az egyik pl. a sejt egy részén halad át, így késik a másikhoz képest, ami pl. a sejt körüli anyagban halad fáziseltolódás mindkét nyaláb esetén újraegyesítés (interferencia) a második Wollaston prizmában csak azok a fáziseltolt egyesített nyalábok jutnak át, amiknek van az analizátorhoz képest megfelelő rezgési síkú komponense

36 Nomarski Differential Interference Contrast (DIC) a térhatás-jellegű kép eléréséhez a DIC-prizma szabályozásával állítható a két (o/eo) nyaláb közötti fáziseltolás a térhatású kép nem közvetlenül morfológiát tükröz, hanem fáziskülönbségeket, de van korreláció a morfológiával A Nomarski DIC csak olyan anyagok esetében működic, amik nem depolarizálnak (mint ahogyan azt teszi pl. a műanyag) Műanyag Petri csésze vagy multiwell-plate esetén pl. Hoffman modulációs kontraszt vagy Relief kontraszt alkalmazható

37 Fluoreszcencia

38 Széleslátóterű fluoreszcens mikroszkópia A fluoreszcens molekulák a minta meghatározott területein elhelyezett fényforrásként viselkednek, meghatározott színű fénnyel mutatva a helyzetüket. Ezen indikátorok energiát igényelnek ahhoz, hogy fényt emittáljanak ezt az energiát a mikroszkóp fényforrásából származó gerjesztő fény adja a fluorokrómnak. Minden fluorokrómnak megvan a gerjesztéséhez szükséges meghatározott hullámhossz-tartománya (pl. FITC: kék, azaz kb. 480nm gerjesztés). Ez két fényutat jelent, amiket el kell különíteni: Egyrészt a gerjesztő fény a fényforrásból a mintára, Másrészt az emittált fény a mintáról (fluorokróm) a detektorra. Az elválasztást a Stokes-féle eltolódás (Stokes shift) teszi lehetővé, ami azt a tényt fogalmazza meg, hogy az emittált fluoreszcens fény hullámhossza általában hosszabb, mint a gerjesztő fény hullámhossza.

39 Széleslátóterű fluoreszcens mikroszkópia Például a kék gerjesztés zöld emissziót eredményez a FITC fluorokróm esetében. Minden fluorokrómnak megvan a saját gerjesztési és emissziós spektruma.

40 Széleslátóterű fluoreszcens mikroszkópia A fluoreszcens aktivitás sematikus ábrája a Jablonski energiadiagrammal illusztrálható. Az elnyelt fény energiája a fluorokróm elektronjait gerjeszti alapállapotból magasabb energiájú állapotba. Ezek a kapott energia egy részét rezgési és forgási energiaként elhasználják, a maradékot pedig fluoreszcens fény formájában kisugározzák, miközben visszatérnek alapállapotú energiaszintjükre kb. 10ns alatt.

41 Széleslátóterű fluoreszcens mikroszkópia A fókuszon kívülről érkező zaj kiszűrése Dekonvolúció (matematikai képrekonstruáló eljárás, SW) Struktúráltfényű megvilágítás (SW) Spinning Disk (fókuszon kívüli információ részbeni maszkolása, Nipkov disk, DSU, HW) TIRFM (Total Internal Reflection Microscopy, HW) Konfokális apertura (fókuszon kívüli információ maszkolása pinhole-lal, CA, HW)

42 Mélységélesség összehasonlítás Standard széles látótér DSU LSM TIRFM

43 DSU optika CCD szűrőváltó FS D/M Spinning disk szűrőváltó felülnézet 100% tükör obj oldalnézet

44 A DSU elmélete Az Airy korong mérete függ az objektív nagyításától és NA-jától, valamint a hullámhossztól => a rések szélességét és távolságát az objektívhez kell igazítani

45 A DSU elmélete Konfokalitás nélkül 1D konfokalitás (x-tengely) 1D konfokalitás (y-tengely)

46 DSU korong hatásfok Gerjesztő fény 57% DSU korong W 5% L L fluoreszcencia L = 0.6R (R : Airy Disk) W = 10R

47 R X-Y Spatial resolution 1.2 R:Airy Disk átmérője λ:hullámhossz M:nagyítás NA:objektív NA M NA d K n 1 Confocal Axial Resolution 1 Mélységélesség (DoF) Slit disk : Point scanning =0.95:0.67 NA n 2 száraz : n=1 vizes : n=1.33 olajos : n=1.5 Slit Disk : K=0.95 Point Scan: K=0.67

48 TIRFM

49 fedőlemez objektív BFP (Back focal plane) lézernyaláb

50 fedőlemez objektív BFP (Back focal plane) lézernyaláb

51 Evanescent wave fedőlemez objektív BFP (Back focal plane) lézernyaláb

52 Detektálási technológiák CMOS (Complementary metal oxide semiconductor) CCD (Charge Coupled Device) EMCCD (Electron Multiplier Charged Coupled Device) PMT (Photomultiplier Tube) APD (Avalanche photodiode)

53 Fejlett képalkotó technológiák és műszaki megoldások clsm (confocal Laser Scanning Microscopy) FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging) FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy) MPE (Multi Photon Excitation Microscopy)...

54 clsm A konfokális lézer pásztázó mikroszkóp fókuszált lézernyalábot használ a vizsgált minta kis területének megvilágítására. A lézer frekvenciája az adott minta fluorokrómjára hangolva fluoreszcenciát gerjeszt, így a minta egy kis területéről érkező emissziós jel felfogható egy detektorral. A konfokális lézer pásztázó mikroszkóp felbontását behatárolja azon pont mérete, amire a gerjesztő fény fókuszálható. Ez a méret függ a használt rendszer optikai paramétereitől, de közelítőleg a gerjesztő nyaláb hullámhosszának nagyságrendjébe esik.

55 clsm A clsm laterális felbontása Az laterális felbontás tárgyalása olyan optika képalkotást ír le, ami a véges numerikus apertúrát és a fény hullámtermészetét is figyelembe veszi. Az intenzitás eloszlását a point spread function (PSF) írja le, ami egy optikai rendszer válaszát adja meg (így válasz-függvénynek is hívják). Az első sötét gyűrű pozíciója azonos, de a csúcs keskenyebb és a keskenyebb eloszlás jobb felbontást eredményez. Ennek oka az Airy-disk FWHM ( full width at half maximum ) értéke, ami clsm esetében 35%-kal jobb, mint a hagyományos mikroszkópnál. Ebből adódik, hogy a clsm elméleti felbontása: r lateral = 0.4 λ / NA

56 clsm A laterális felbontás nagyon érzékeny a CA méretére és a megadott elméleti érték a gyakorlatban aligha érhető el. (Az Olympus 0.5-tel számol.) A clsm axiális felbontásának definíciója az elméletben: A clsm axiális felbontását az FWHM határozza meg, vagy a maximális irradiancia érték felénél mért irradiancia-eloszlás teljes szélessége, feltéve, hogy A minta végtelenül vékony fluoreszcens minta. A CA végtelenül kicsi. Az optikai rendszer aberrációktól mentes. Az axiális felbontás kevéssé érzékeny a CA méretére, így az a CA növelésével sem romlik jelentős mértékben.

57 A clsm elv tárgy kép fókuszsík

58 A clsm elv tárgy kép fókuszsík

59 A clsm elv A fókuszpontra rárakódik a fókuszon kívüli pontok zaja Romlik a laterális és axiális felbontás Romlik a kép kontrasztja A konfokális mikroszkópban két pinhole van elhelyezve a konjugált fókuszsíkokban A fókuszpontra nem rakódik fókuszon kívüli zaj A laterális és axiális felbontás javul A kép kontrasztja javul Lehetővé válik az optikai szeletelés

60 A clsm elv Conjugated Focalplanes (CONFOCal): mezőrekesz és képsík Pinhole a képsíkban Lézernyaláb a mezőrekesz síkjára fókuszálva (a pinhole itt szükségtelen)

61 clsm fényforrás a lézer LASER: Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation A gázkeverékben az atomokat energiával gerjesztik (pl. fényvillanásokkal) koherens (azonos fázisú) fény. A lézertubus két végén speciális tükrök a fény intenzitása nő és lézertől függően egy vagy több hullámhossz képződik.

62 clsm lézervezérlés AOTF AOTF: Acoustic Optical Tuneable Filter Egy piezzo elem állóhullámokat hoz létre egy kristályban. Ez a hullám elhajlítja a beérkező fénynyalábot. Az eltérítés mértéke függ a fény hullámhosszától és az állóhullám frekvenciájától. A látható tartományban minden lézervonal manipulálható. A gerjesztő fény be- és kikapcsolása, valamint vezérlése a µs tartományban végezhető.

63 clsm képalkotás lézer pásztázás A pásztázás folyamata : A fókuszált lézernyalábot galvano tükrök végigvezetik a megadott útvonalon a minta kiválasztott területén Pásztázás során a fluoreszcnes jelet pontonként kiolvassák és a pontokból képet formálnak Mivel a mintát vonal mentén pásztázzák, a pásztázási pozíciót szinkronizálni kell a detektorral.

64 clsm detektálás PMT PMT Photomultiplier Tube A beérkező fényenergia hatására elektronok szabadulnak el a PMTben. Az alkalmazott magasfeszülség (HV) az elektronokat dinódáról dinódára vezeti. Az elektronok energiája újabb elektronokat szabadít fel (erősítés). Több dinóda alkalmazásával, hatékony jelerősítés érhető el (avalanche effektus). Az erősítés mértéke függ a dinódák között alkalmazott feszültségtől. A PMT kimenő jele analóg áram.

65 clsm detektálás PMT A fotoelektron-sokszorozó (PMT) nem lát színeket. A jelhez tartozó színt szoftveres úton rendelik a mért intenzitásértékhez ( false colour ). A PMT analóg jel-árama mégegy erősítésen átesik (elektronikus erősítés, gain). A pásztázott kép minden pixele megfeleltethető a jel-áram egy időpontjában felvett értékével = szinkronizáció. Képalkotás során két módon javítható a kép minősége: Nagy intenzitású gerjesztő fény erős fakító (bleaching) hatás a mintán Nagy erősítés a PMT-n zajos kép

66 Olympus FV1000S

67 clsm Alkalmazások - FRAP FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) A FRAP egy eljárás molekuláris mozgások elemzésére. Mérhető vele diffúziós ráta, molekulák szeparációs sebessége, stb. A sejt egy kiválasztott területén fakítják (bleaching) a fluorokrómot, majd képsorozatot rögzítenek a sejtről (XYt). Új fakulatlan (unbleached) fluorokrómok diffúziója vagy transzportációja jelentkezik a kiválasztott területen. Az eredmény: a fluoreszcens jel felépülése (recovery) vizsgálható és mérhető. A teljes fakulásra elvégzett korrekciót követően megkapható a fluoreszcens felépülés görbéje.

68 clsm Alkalmazások - FRET FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) A FRET jelenség során fluoreszcens molekulák gerjesztési energiája transzferálódik más fluoreszcens molekulákhoz az átviteli hatásfok (transfer efficiency) mértékében, a két molekula relatív pozíciójától függően. A FRET lehetővé teszi pl. két protein molekula közötti kölcsönhatás vizsgálatát, struktúrális változások elemzését és a sejtbeli kálcium-koncentrációról történő képalkotást.

69 clsm Alkalmazások - FLIP FLIP (Fluorescence Loss In Photobleaching) Egy sejt kis területén folyamatosan fakítják a fluorofórt. A kiválasztott területen kívülről a területre érkező fakítatlan fluorofórok mozgásából meghatározható a fluorofórok koncentrációjának csökkenése a sejt más részein. Az intenzitás csökkenését mérve a fakított területen kívül egy csökkenő görbe (decay curve) mutatkozik.

70 clsm Alkalmazások - FLIM FLIM (Fluorescence Lifetime Imaing) A fluoreszcens élettartam a fluoreszcens emisszió időbeli alakulását mutatja, ami a fluorofórok karakterisztikus jellemzője. Az időfüggő (time-resolved) fluoreszcens mikroszkópia lehetővé teszi a fluorofórok vagy azok kémiai környezetének pontosabb megismerését. Az eljárás lényege, hogy nem csak a fluoreszcens intenzitást monitorozza, hanem a fluoreszcens emisszió időbeli fejlődését is. A fluorofórnak bizonyos időre van szüksége ahhoz, hogy a gerjesztett állapotból alapállapotba térjen vissza. E folyamat kvantumtermészeténél fogva a fluoreszcens foton kibocsátása a fluorokrómokból nem egy meghatározott időben történik, hanem egy időbeli eloszlás szerint. Ez az eloszlás egy exponenciális csökkenő (decay) függvénnyel írható le.

71 clsm Alkalmazások - FLIM E csökkenő görbe (decay) karakterisztikus időállandója a fluoreszcens élettartam a néhány pikoszekundum (ps, s) és több tíz nanoszekundum (ns, 10-9 s) közötti tartományban van. A karakterisztikus élettartam a fluorofór jellemzője. Ennek ellenére nem mindig állandó, mivel befolyásolhatja a környezet kémiai összetétele. Ennek oka, hogy a gerjesztet fluorofór nem szükségszerűen emittálja fluoreszcens fényként a gerjesztő energiát, például azt átadhatja más molekuláknak is. Ez a folyamat (quenching) hatással van a fluoreszcens élettartamra, így a kémiai környezetről is nyerhető információ. Az energia fluorofórok között is átadódhat e folyamatot fluoreszcens rezonancia energiatranszfernek (fluorescence resonance energy transfer, FRET) nevezzük.

72 FLIM Alkalmazások Oxigén, víz vagy Ca2+ koncentráció ph érték Távolságok nanométeres skálán Sejtek közötti jelátvitel (intracellular signal transduction) Molekuláris struktúra és dinamika... A FLIM mérés kombinálható a FRET méréssel. A FRET mérésnél használt fluoreszcens élettartam alkalmazásával elkerülhetőek a fluoreszcens emisszió intenzitás-fluktuációjával kapcsolatos problémák.

73 FCS FCS (Fluorescence correlation spectroscopy) Ez a mérési eljárás molekuláris jellemzők (diffúzió és oldatbeli koncentráció) mérésére használható egymolekula-szinten. Az eljárás rögzíti a fluoreszcens emisszió intenzitásának időbeli változásait, amit azon egyedi fluorfórok váltanak ki, amelyek áthaladnak a gerjesztett térfogaton. Ezen intenzitásváltozások kvantifikálhatóak erősség és időtartam szerint a rögzített intenzitás-jel időbeli autokorrelációjával.

74 FCS Alkalmazások Molekuláris asszociáció és disszociáció A minta koncentrációjának mérése femtoliteres térfogatban Fluorofórok laterális és rotációs diffúziójának vizsgálata Konformáció-dinamika Kinetikus rátaállandó mérése Enzim- és intracelluláris dinamika in vitro, vagy akár élő sejtben... Az FCS méréshez alapvetően folyamatos hullámú lézer szükséges, azonban pulzus üzemű lézerek használata esetén még szofisztikáltabb lehetőségek válnak elérhetővé, mint pl. az időkapus (timegated) FCS vagy a fluoreszcens élettartam FCS (FLCS). Az FLCS alkalmazható pl. a detektor hibáinak (pl. afterpulsing) korrigálására vagy a szóródás járulékának (scattering contribution) meghatározására. Az FLCS lehetővé teszi a koncentráció és két átlapoló emissziós spektrumú, de különböző élettartamú festék diffúziós sebességének egyidejű monitorozását egyetlen detektor használatával.

75 További clsm Alkalmazások Photo Stimulation 3D Imaging PA-GFP (Photo Activatable-Green Fluorescent Protein) Fluorescent protein PA-GFP can be used to mark targeted cells, organelles and proteins. Spectral Unmixing Colocalization Uncaging TIRFM (Total Internal Reflection Microscopy) MPE (Multi Photon Excitation)...

76 OLYMPUS clsm rendszerek Magyarországon ELTE TTK Biológiai Intézet (Dr. Matkó János) OGYK Sejtbiológiai Kutató Laboratórium (Dr. Homolya László) MTA KOKI (Dr. Nusser Zoltán, Dr. Vizi E. Szilveszter, Dr. Rózsa Balázs) MTA KKKI (Dr. Lasztóczy Bálint) MTA SZBK Cellular Imaging Laboratórium (Dr. Ferhan Ayaydin) SZTE ÁOK Orvosi Biológia (Dr. Szabad János, Dr. Belecz István) DE OEC Anatómiai Intézet (Dr. Antal Miklós) DE OEC Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet (Dr. Vámosi György) PTE ÁOK Orvosi Biológia (ifj. Dr. Sétáló György)

77 MPE Neuron Image in depth 2PE Surface Cerebellum/Purkinje 400mm Cerebral cortex Astroglia FV1000MPE Image Files XYZ stack 700 µm deep - 4 µm steps (AVI File 180 MB / 16 MB) H. Waki, T.Nemoto, J.Nabekura, Nat. Inst. F. Physiological Sciences, Nat. Inst. Of Natural Sciences, Japan Cerebral cortex Blood vessels 800mm

78 Gerjesztő fény 1 foton 2 foton Gerjesztett állapot Gerjesztő fény Fluoreszcencia Fluoreszcencia Alapállapot Egy foton elnyelése < 100mW 100fs >300kW Kb. fél energia (=dupla frevencia) Két foton egyidejű elnyelése

79 2-foton gerjesztés Két foton elnyelésének valószínűsége kevesebb, mint 1 : az egy foton elnyeléséhez képest Nagy energiájú rövid pulzus gerjesztés Femtoszekundumos IR lézerrel a kétfoton-abszorpció feltételeinek előállításához Mennyi idő a Femtoszekundum? = sec = 0, sec - IR Pulzus 100fs = sec

80 2-foton gerjesztés Ti:Sapphire IR Lézer fontosabb adatok: Hangolható hullámhossz ( nm max.) a nyaláb átmérője enyhén változik - a nyaláb finomhangolása szükséges MHz ismétlési ráta = pulzus per mp Időbeli reláció: Pulse Intervall Pulse - Intervall - Pulse 1 : : 1 : : kw csúcsintenzitás = 100 Mio x nagyobb intenzitás a konstans hullámú lézerekhez képest (1 30 mw) 1,5 800 nm (referencia hullámhossz)

81

82 2-Photon excitation - high photon density in the focal point no excitation outside the focal point & less optical damage acquire intensity image of optical cross section without pinhole - focal excitation laser stimulation & bleaching in focal point / focal plane Illumination Single Photon Multi Photon Single Photon Multi Photon Excitation area Sample Uncaged outside focal point Caged compound Uncaged local focal point Not uncaged outside focal point

83 STED Stimulated Emission Depletion Technique that uses the non-linear de-excitation of fluorescent dyes to overcome the resolution limit imposed by diffraction. Stimulated Emission Depletion microscopy reduces the size of the excited region by using a very short excitation pulse which is immediately followed by a "depletion" pulse, tuned to an emission line of the fluorescent dye. This depletion pulse causes stimulated emission, moving electrons from the excited state (from which fluorescence occurs) to a lower energy state. The wavefront of the depletion beam is altered in such a way that it is focused to a ring instead of a spot, featuring a dark spot of zero laser intensity in the center. While this dark spot is itself diffraction-limited, the intensity distribution is continuous and is zero only at the center. Therefore, using a bright depletion pulse causes almost all of the electrons excited by the excitation pulse to return to the ground state, leaving only the region of the sample very close to the axis of the depletion beam excited. After both pulses have been sent, fluorescence from the remaining excited dye molecules is detected by the microscope.

84 While the blue excitation (EXC) beam is focused to a diffraction-limited excitation spot, shown in the adjacent panel in blue, the orange STED beam is able to de-excite molecules. The STED beam is phase-modulated to form the focal doughnut shown in the top right panel. Superimposition of the two focal spots confines the area in which fluorescence is possible to the doughnut centre, yielding the effective fluorescent spot of subdiffraction size STED

85 STED The spot size and hence the resolution r of a STED microscope follows a new law, where - wavelength n sin - NA of lens I - maximal focal intensity applied for STED I sat - characteristic value at which the fluorescence probability is reduced to ~1/e Unlike in a confocal or epifluorescence light microscope, here for I/I sat it follows that r 0, meaning that the resolution is no longer limited by diffraction.

86 AJÁNLOTT IRODALOM Kísérleti fizika III. (Budó-Mátrai, Tankönyvkiadó, 1989) Orvosi biofizika (Damjanovich-Fidy-Szöllősy, Medicina, 2006)

87 Köszönöm a figyelmet.