Gyors-kinetikai módszerek

Átírás

1 Gyors-kinetikai módszerek Biofizika szemináriumok Futó Kinga

2 Gyorskinetika - mozgástan Reakciókinetika: reakciók időbeli leírása reakciómechanizmusok reakciódinamika (molekuláris szintű történés) reakciósebesség: a reakció jellemzésére szolgáló paraméter

3 Sebességi törvény Reakciósebesség függ: résztvevő anyagok minősége koncentrációk hőmérséklet katalizátor / inhibitor reakciórendek (Nem sztöchiometriai együtthatók!) a+b: bruttó reakciórend

4 Reakciósebesség koncentráció-függése

5 Molekularitás Unimolekulás reakció: egyetlen molekula átalakulása Bimolekulás reakció: két molekula átalakulása azok ütközése útján Trimolekulás reakció: ritka, mert több molekulának kell ütköznie ELEMI REAKCIÓK nem bonthatók egyszerűbb lépésekre Elemi reakciók rendűségét a reakció molekularitása határozza meg.

6 Folyamatok rendűsége és a molekularitás kapcsolata 0. sebességi állandó 1. kiindulási anyag koncentrációja termék(ek) koncentrációja 2.

7 3%B3sebess%C3%A9g Nulladrendű reakció pl. enzimkatalízis (ha az enzim koncentrációja kicsi) - NEM elemi reakció!!! 1. t 1/2 2. t 1/2 3. t 1/2 A komponensek koncentrációja lineárisan változik az idő függvényében.

8 3%B3sebess%C3%A9g Elsőrendű reakció A B vagy A B + C 1. t 1/2 2. t 1/2 3. t 1/2 A komponensek koncentrációja exponenciálisan változik az idő függvényében.

9 3%B3sebess%C3%A9g A komponensek koncentrációja hiperbola függvény szerint változik az idő függvényében. Másodrendű reakció 2A B (vagy A + B C) 1. t 1/2 2. t 1/2 3. t 1/2

10 Összetett reakciók = reakciómechanizmusok Sorozatos kémiai reakciók: sebességmeghatározó lépés: B C sebességmeghatározó lépés: A B Párhuzamos kémiai reakciók: Egyensúlyi állandó: Egyensúlyi kémiai reakciók:

11 Energetika Az eredményes ütközéshez a molekuláknak aktív állapotba kell jutni, többletenergiával kell rendelkezni. A küszöbenergia és az átlagos energia közötti különbség az aktiválási energia.

12 Gyorskinetikai módszerek jelentősége biológiai mechanizmusok megértése biológiai folyamatok időskálája millisecundum skálán történő mérések gyorskinetikai módszerek időfelbontása: s ms ms ns ps lombik reakció topped flow illanófény fotolízis gyfoton-számlálás Keszei Ernő előadása alapján

13 Gyorskinetikai módszerek Stopped-flow (megállított áramlású reaktor) Surface Plasmon Resonance Flash Photolysis (villanófény fotolízis) Photon Counting (foton-számlálás)

14 Stopped-flow Megállított áramlású reaktor

15 0. Betöltés keverő cella stop A B meghajtó STOP szenzor

16 1. Keverés meghajtó STOP szenzor

17 1. Keverés meghajtó STOP szenzor

18 1. Keverés meghajtó STOP szenzor

19 1. Keverés meghajtó STOP szenzor

20 2. Az áramlás megállítása t = o meghajtó STOP!

21 3. kinetikai mérés fluoreszcencia v. szórás abszorpció meghajtó STOP szenzor

22 Holtidő A folyadékok összekeverése és a hasznos mérés kezdete között eltelt idő 0,5 1 ms

23 Holtidő

24 Forrás: Applied Photophysics Holtidő

25 Stopped-flow alkalmazása kötődési- és disszociációs kinetika vizsgálata fehérje-fehérje, illetve fehérje-ligandum kölcsönhatás esetén K D : disszociációs állandó K D A B AB

26 Mért jel spektroszkópiai jel változzon a reakció során! fluoreszcencia intenzitás (v. anizotrópia) fényszórás abszorpció párhuzamos detektálás! merőleges detektálás! detektor: PMT

27 Villanófény fotolízis (a molekulák fény hatására történő felbomlása)

28 Villanófény-fotolízis Rövid élettartamú részecskék reakcióinak nyomon követésére. Caged molekula: ketrecbe zárva, kémiai kötéssel inaktiválva Nagy fényintenzitás hatására kiszabadul (az inaktiváló kémiai kötés felbomlik) ekkor indul a folyamat. Előnye: A és B molekula már egymás mellett van (keverés nem vesz el időt). Csak akkor indul a folyamat, amikor meglőjük fénnyel. Detektálva a fényt, megmondható a spektroszkópiás mérés nulla időpontját.

29 Felületi plazmon rezonancia (SPR)

30 Felületi plazmonok Fémek felületén egy speciális fénysugárral hullámszerű mozgásra kényszerített elektronok. Hullámhossza rövidebb a gerjesztő fényénél. Távoli tér: megvilágított tárgyról visszaverődő fény segítségével megfigyelhetjük a tárgyat, mikroszkópon vagy távcsövön keresztül. A fényhullámok elektromos és mágneses tere azonos nagyságú és kölcsönösen függ egymástól. Közeli tér: A fény azon komponense, ami a felülethez ragad A mágneses komponens gyenge az elektromoshoz képest (nem lép fel diffrakció, interferencia).

31 commons/7/78/spr-schema.png Plazmon létrehozása Kretchmann konfiguráció Diszperziós összefüggés: a plazmonok energiája és hullámhossza (impulzusa) közötti kapcsolatot írja le. Hatékony gerjesztés: ha a két hullámhossz vagy annak reciproka, az impulzus egyezik (impulzusmegmaradási törvény). Az üvegekben a fény hullámhossza rövidebb, mint a levegőben. Az impulzus nagyobb. Teljes visszaverődés a prizma-levegő határfelületen, de a felület levegő felőli oldalához hozzátapadva és attól távolodva exponenciálisan csökkenő térerősséggel megjelenik a közeli tér.

32 A rezonancia feltétele A gerjesztő fény impulzusának felülettel párhuzamos komponense meg kell egyezzen az azonos energiájú felületi plazmon impulzusával. A gerjesztés a fény egy adott beesési szögénél történik meg és ilyenkor a fém felületről visszavert fény intenzitásában egy minimum észlelhető (abszorpció!).

33 Az alapelv B partner fémlemez (pl. arany v. ezüst) üveg A partner fényforrás detektor

34 Az alapelv E fémlemez (pl. arany v. ezüst) üveg elhajlás (csökkenés) az intenzitásban!

35 A szenzogram a jel eredete fémlemez (pl. arany v. ezüst) üveg I. II. A kötés megváltoztatja a visszaverődés szögét.

36 A detektálás A rezonanciának megfelelő beesési szög értéke érzékenyen függ a másik közeg (prizma) törésmutatójától. A bekötődés megváltoztatja a felülettel érintkező réteg törésmutatóját rezonancia szög eltolódás érzékeny detektálás. Analitikai és kinetikai információ: rezonancia szög időbeli változása.

37 commons/3/3d/spr-curve.png Affinitás meghatározása Kötési állandó meghatározása A termék egyensúlyi állandója: asszociációs állandó / disszociációs állandó. csali ligand rákötése a felszínre préda ligand injektálása préda köt a csalihoz SPR jel növekszik. Asszociáció után: Prédamentes oldat injektálása disszociáció SPR jel csökken. Asszociációs és disszociációs ráta kötési állandó

38 Alkalmazási területek Ellenanyag antigén DNS hibridizáció Protein protein Receptor biomolekula kölcsönhatások Kinetikai állandók és molekuláris kölcsönhatások specificitásának meghatározása Nyomanalitikai meghatározások Spektroszkópos mérések felületi érzékenységének növelése: fluoreszcencia, Raman-szórás.

39 Hogyan sétál a kinezin?