Abszorpciós fotometria

Átírás

1 A fény Abszorpciós fotometria Ujfalusi Zoltán PTE ÁOK Biofizikai ntézet szeptember 15. E B x x Transzverzális hullám A fény elektromos térerősségvektor hullámhossz Az elektromos a mágneses térerősség vektorai merőlegesek egymásra, valamint a haladási irányra! Fény anyag kölcsönhatása Kvantált energiafelvétel (foton) Atomi rendszerrel (anyaggal) kölcsönható elektromágneses sugárzás: visszaverődhet (reflexió) elnyelődhet (abszorpció) áthaladhat (transzmisszió) Fontos fizikai mennyiségek, összefüggek A fény kettős termzete: Frekvencia: n (1/s) Hullám (terjedkor) Rzecske (kölcsönhatáskor) Hullámhossz: (m) Hullámszám: n (cm -1 ) c v 1 Energia: E (J) h. n Einstein: foton (fénykvantum) energiája Elhajlás (diffrakció) nterferencia Polarizáció Fotoeffektus Compton-effektus Vizsgált sugárzás színképre (spektrum) bontható, ami eredete szerint lehet: emissziós vagy abszorpciós Extinkc. koeff.: (M -1 cm -1 vagy (mg/ml) -1 cm -1 ) 1

2 A spektrum Egy hullám, például elektromágneses hullám felhasadása alkotó frekvenciáira. Egy intenzitás-jellegű mennyiség ábrázolva egy energiajellegű mennyiség függvényében. energia azzal arányos mennyiségek (pl. frekvencia, hullámhossz, hullámszám) A spektrumok megjeleni formái vonalas (atomok) sávos (molekulák) folytonos (hevített anyagok) n intenzitás, beütszám (pl. radioaktivitás mére), fotonszám, transzmittancia, abszorbancia (extinkció, OD) (nm) Folytonos emissziós Vonalas emissziós Vonalas abszorpciós Néhány elem vonalas (emissziós) spektruma He Hg Na Ne Ar Az energia felbontása Abszorpció E összes = E elektron + E vibrációs + E rotációs Az energiatípusok nagyságrendje: E elektron ~ 1,000 * E vibrációs ~ 1,000,000 * E rotációs = ( ) x c Lambert-Beer törvény ( ) : az extinkciós koefficiens (anyagi minőségtől függ), c: a koncentrációja, x: az optikai úthossz 2

3 Az abszorpció Miért ( ) nemcsak? - legyen könnyen érthető - legyen jól mérhető - legyen additív E OD A = - log ( / 0 ) = ( ). c. x Megjegyz: a transzmittancia (T=/ 0 ) nem additív! (nm) Mert az abszorpció függő, így az is az kell hogy legyen! Transzmisszió Hogyan mérjük az abszorpciót? 0 fotometria = abszorpciós spektroszkópia fényforrás detektor Egy fotométer egyszerű sémája: fényforrás monokromátor detektor T = / 0 Általában százalékban (%) adjuk meg. Prizma vagy optikai rács + r Folytonos fényű, pl.: halogén, deutérium, xenon, stb. lámpa műanyag, üveg, kvarc küvettákban Egy- két-utas fotométerek 3

4 Az emisszió az abszorpció mére A fotométer linearitása; stray light effect emisszió Tér bármely irányából! Várható tendencia Meredekség: abszorpció Csak lineáris elrendezben! koncentráció A fotométer linearitása; stray light effect Kicsi abszorpció mellett A probléma oka: nem tökéletesek a monokromátorok! 0 99% kiválasztott 89% kiválasztott Optikai rács Második, harmadik, stb. felharmónikusok! Nagy abszorpció mellett Fényszórás 0 Tömény (nagy koncentrációjú) mintáknál jelentkezhet a stray light effect mellett! 99% kiválasztott 1% kiválasztott Ezt is érzékeli a detektor!!! 4

5 Az abszorpciós fotometria alkalmazásai A fehérjék abszorpciója Különböző oldatok (pl. fehérjeoldatok!!!) koncentrációjának meghatározása dőfüggő változások nyomonkövete Elektroforézis minták kiértékele A fehérjék abszorpciójának értelmeze Az alapvonal (baseline) jelentősége Fehérje PUFFER!!! 5

6 Additivitás Alkalmazás: fehérjekoncentráció meghatározása fehérje fluoreszcens próba (nm) dőfüggő mérek 0,2 Abszorpció egyéb alkalmazása Elektroforézis minták kiértékelénél Anyagi, minőségbeli, szerkezeti változások követe (pl. kémiai reakciók hatására) Abszorpció 0,0-0,2-0, idõ (s) 6