Lumineszcencia: a fényt kibocsátó rendszer nem a magas hőmérséklet miatt világít!!! Ez az ún. hideg emisszió

Átírás

1 Fluoresz Fluores zcenc cencia ia spektroszkópia Lumineszcencia: a fényt kibocsátó rendszer nem a magas hőmérséklet miatt világít!!! Ez az ún. hideg emisszió emisszió jelensége. Orbán József Biofizika szeminárium PTE ÁOK Biofizikai Intézet Február Szinglet és triplet állapot (molekulák) Molekulákból vagy ionokból: molekuláris lumineszcencia Alapjelenségeit a Jablonski-féle séma szerint értelmezzük. Lumineszcencia felhasználás 0 Energia Eredő spin? s = S =? S=0 Multiplicitás: = 2 S+1 2 S+1 M=1 S=1 M=3 S1 T1 h Abszorpció S0 Pauli elvnek megfelel engedélyezett átmenet S0 Pauli elvnek ellentmond tiltott átmenet 1

2 Lumineszcencia Biolumineszcencia 1. Kemilumineszcencia olyan fényemisszió, fényemisszió, amelyhez szükséges gerjesztő energia adott kémiai reakció során felszabaduló energiából adódik pl.: foszfor (P) oxidáció útján való világítása alkalmas anyagcsere folyamatok vizsgálatára kis ki intenzitású i t itá ú fiziológiás viszonyoktól függő Fotók: James Jordan Biolumineszcencia Biolumineszcencia: a kemilumineszcencia egyik típusa, Biolumineszcencia: amikor a gerjesztő energiát biztosító kémiai reakció élő organizmusban játszódik le. le. 1. A luciferáz katalizálja a luciferin oxidációját. 2. Inaktív oxyluciferin és fény (h ) keletkezik A további luciferin a táplálékból vagy belső szintézisből pótlódik. 2

3 2. Fotolumineszcencia JabłonskyJabłonsky -féle termséma molekuláris rendszerre IC: internal conversion Belső átrendeződés S2 VR: vibrációs relaxáció Termikus relaxáció ISC: intersystem crossing S1 Rendszerek közti átmenet T1 Abszorpció p Emisszió h olyan fényemisszió, fényemisszió, amelyhez szükséges gerjesztő energia adott hullámhosszú (frekvenciájú, energiájú) fény besugárzásából adódik alkalmas molekuláris rendszerek vizsgálatára, mert jelentős információt hordoz a molekula tulajdonságairól, kölcsönhatásairól, környezetével való kapcsolatáról Energia 0 h S0 fluoreszcencia A gerjesztési spektrum A lumineszkáló anyagot jellemzi: Abszorpciós spektruma, valamint fluoreszcencia/foszforeszcencia é é ó spektruma gerjesztési és emissziós Sugárzás kvantumhatásfoka foszforeszcencia Egy rögzített emissziós hullámhosszon detektálunk. Az intenzitást a gerjesztési hullámhossz függvényében mérjük. Függvényalakja az abszorpciós spektruméval megegyezik. Gerjesztés Gerjesztett állapot élettartama Emisszió polarizációfoka (anizotrópiája) Stokes-féle eltolódás, tükörkép spektrumok Sir George Gabriel Stokes, 1st Baronet ( ) 3

4 Emissziós spektrum Hogyan mérjük a fluoreszcenciát fluoreszcenciát?? Miért kell emissziós monokromátor? ex fényforrás gerjesztési monokromátor Minta em Fény (gerjesztés) Fény (emisszió) Elektromos jel (tartomány, sáv) emissziós monokromátor Egy rögzített gerjesztési hullámhosszon detektálunk ( ex,max). Az intenzitást az emissziós hullámhossz függvényében mérjük. Függvény alakja az emissziós spektrumot adja meg. intenzitás Egy fluoriméter működésének elméleti sémája Ha 1 -on gerjesztünk milyen emissziós színképet kapunk? Vonalast? Gerjesztés Emisszió Kiértékelés (PC) Detektor ex,max Ha más -on g j gerjesztünk mint az optimálison? Kasha szabály hullámhossz bizonyítéka! A gerjesztési spektrum intenzitás Egy rögzített emissziós hullámhosszon detektálunk. Az intenzitást a gerjesztési hullámhossz függvényében mérjük. Függvényalakja az abszorpciós spektruméval megegyezik. Ha 1 -on gerjesztünk milyen gerjesztési színképet kapunk? Vonalast? Gerjesztés Emisszió ex,max Ha más -on gerjesztünk g j mint az optimálison? hullámhossz 4

5 Gerjesztett - alapállapot átmenet Kvantumhatásfok A rendszer többféle úton adhatja le az energiát fény formájában: fluoreszcencia során kibocsátott és elnyelt fotonok számának hányadosa. b. Foszforeszcencia = Nemitt / Nabsz < 1 c. Késleltetett fluoreszcencia - kifejezhető a sebességi állandók hányadosaként is: = kf / (kf + kössz) a. Fluoreszcencia d. ISC, IC, VR f fluoreszcencia össz f + vibr. + rot. (azaz f + non-radiatív) A sebességi állandó arányos a folyamat valószínűségével! Fluoreszcencia élettartam Az az időtartam, amely alatt a gerjesztett g j állapotban p található molekulák száma e-ad részére csökken. = 1 / (kf + kössz) Fluoreszcencia élettartam mérése idő-függő mérés ( time domain measurement ) Intenzitás Idő (ns) 5

6 Fluoreszcencia élettartam mérése frekvencia-függő mérés ( frequency domain measurement ) Fluoreszcencia élettartam mérése frekvencia-függő mérés ( frequency domain measurement ) Modulált gerjesztés (frekvencia ~20 / 80 MHz) Eltelt idő In ntenzitás Intenzitás Demoduláció Fáziseltolódás Emisszió rövid élettartamé (pl. 1 ns) Emisszió hosszú élettartamé (pl. 10 ns) Modulált gerjesztés (50 MHz) Eltelt idő Fluoreszcens Fluores zcens festékek natív vagy intrinsic fluorofórok: IAF Triptofán tirozin, Triptofán, tirozin fenilalanin Előnyük: Nem kell módosítani a fehérjét. külső vagy extrinsic fluorofórok: IAEDANS Denzil fluoreszcein, Denzil, fluoreszcein rodamin, rodamin kumarin, kumarin stb. stb PIRÉN Aequorea victoria GFP (green fluorescent protein) szalagdiagrammja 6

7 Kémiai háttér R Könnyű gerjeszteni az elektronokat, ha Aromás gyűrűben, vagy Konjugált kettős kötésű rendszerben találhatók. ZÖLD KÉK Minél több kettős kötés van a molekulában, annál kisebb energia kell a gerjesztéshez! Hangolható, tervezhető! 7

8 A fehérjék fluoreszcens jelölése -A jelölők minősége és elhelyezkedése tervezhető. - A fluorofórokat specifikus kötőhelyekhez kapcsoljuk. - Így a fehérje módosulhat, aktivitását tesztelni kell. Jelölés specifikus antitestekkel (immunfluoreszcens, immunhisztokémiai jelölés) Az antitest nagy affinitással és specifitással kötődik az általa felismert molekula felszínéhez (epitóp) Monoklonális és poliklonális antitestek Direkt jelölés: az antitesthez fluoreszcens festék van kötve Indirekt jelölés: az elődleges antitest jelöletlen, a másodlagos antitest van megjelölve A mérés alapelvei Legfontosabb probléma: a gerjesztő fény és az általa okozott lumineszcencia fény elkülönítése térben és/vagy hullámhossz szerint I. Fluoreszcencia mérésénél A gerjesztési és észlelési irányok célszerű megválasztása Három elrendezés Térbeli és/vagy szelekció.!! Fényszűrők, monokromátorok!! 1. Az észlelés iránya merőleges a gerjesztés irányára. 2. A gerjesztés és az észlelés iránya párhuzamos. A minta elülső oldaláról kilépő fluoreszcenciát érzékeljük. 3. A minta gerjesztésével szemközti oldalon, azaz lineárisan detektálunk. 8

9 II. Foszforeszcencia mérésénél A foszforoszkóp A gerjesztő fény a foszforeszcencia fénytől időben elkülönüljön Az intenzitás időbeli változása is mérhető legyen Mindig alacsony hőmérsékleten ékl kell mérni Foszforoszkóp alkalmazása: A mintát gerjesztés után optikai ernyővel eltakarjuk, ekkor juthat a detektorhoz az emittált fény. A forgó átlátszatlan henger résén a gerjesztő fény áthatol, de a foszforeszcenciaf a henger falán nem jut át Az az idő, amely a gerjesztés befejezése és a megfigyelés kezdete között eltelik függ: a forgási sebességtől a nyílások számától Gyakorlatilag elérhető legrövidebb idő: 10-5 s nagyságrendű Negyedfordulat után a gerjesztő fény útja záródik el, a foszforeszcencia a detektorhoz jut a henger másik részén A minta Általában oldat (fehérje, nukleinsav, pigment extraktum, sejtszuszpenzió) A küvetta anyaga ne fluoreszkáljon! Üvegküvetta (látható tartomány) Speciális üvegküvetta (λ > 300 nm) Műanyag küvetta Speciális kvarcküvetta (fluoreszcencia mérésre) Küvetta tartó berendezések: Temperálható (több féle módon) Több (ált. 4) minta, forgatható Gerjesztő fényforrások A mesterséges fényforrások által kibocsátott fény lehet: Folytonos-, (magas hőmérsékletre hevített anyag) Halogéntöltésű izzószálas lámpák. Nagy nyomású gázokkal töltött lámpák. Vonalas-, (atomok) Intenzív, monokromatikus fény állítható elő. Alacsony nyomású higanygőzzel ő töltött gázkisülési cső. 9

10 Optikai szűrők Szelektivitás bizonyos hullámhosszúságú fényre Abszorpciós filterek Általában üvegből készülnek. Szerves vagy szervetlen összetevőket tartalmaznak, emiatt bizonyos hullámhosszúságú fénysugarakat átengednek, míg másokat nem. Műanyag (olcsóbb, könnyebb) Dikroikus tükrök Optikai szűrők Ultraibolya (UV) filterek: Az ultraibolya-fényt nem engedik át, de hosszabb hullámhosszúakat igen. Neutrális szűrők: Transzmissziójuk széles színképtartományban a hullámhosszúságtól független. A gerjesztő fény intenzitásától függő fotokémiai, fotobiológiai folyamatok tanulmányozhatók. Interferencia szűrők: Akkor használjuk, ha a folytonos színképű fényből viszonylag keskeny sávot akarunk kiválasztani. Vonalas színképű gerjesztő fényből meghatározott hullámhosszúságnál fellépő vonalat kell elkülönítenünk. Áteresztőképességük a beeső fény beesési szögétől függ. Optikai szűrők Longpass-filterek (Felüláteresztő szűrők) Magasabb hullámhosszú fénysugarakat enged át. Általában éles csúcs jellemzi őket. Fluoreszcens mikroszkópiában a dikroikus tükrök emissziós filterekként használatosak. Shortpass filterek (Aluláteresztő szűrők) Optikai interferencia vagy színezett üveg filterek. Rövidebb hullámhosszú fénysugarakat enged át. Dikroikus tükrök excitációs filterek-ként használatosak. Bandpass filterek (Sáv szűrők) Előző kettő kombinációja. Általában alacsonyabb transzmittancia-érték mint az előzőeknél. A kiválasztott intervallumon kívül teljesen blokkol minden más hullámhosszú fényt. A: Fényforrás B: Rés C: Kollimátor D: Prizma vagy rács E: Tükör F: Excitációs rés G: Minta Monokromátorok 10