Lumineszcencia spektroszkópia

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Lumineszcencia spektroszkópia"

Vince Boros
5 évvel ezelőtt
Látták:

revencia-üggése - Abszorbancia (optiai denzitás, extinció), transzmittancia, extinciós oeiciens - Atomo energiaszintje, oton energia rezonancia eltétel, LUMINESZCENCIA - Lumineszcencia típuso

1 Lumineszcencia spetroszópia 203. ebruár Bioizia II. élév Orbán Józse PTE ÁOK Bioiziai Intézet Deiníció, törvénye SPEKTROSZKÓPIAI ALAPOK ISMÉTLÉS - Spetrum típuso (abszorbciós/emissziós és vonalas/sávos/olytonos) - Fehér ény, spetrum, intenzitás revencia-üggése - Abszorbancia (optiai denzitás, extinció), transzmittancia, extinciós oeiciens - Atomo energiaszintje, oton energia rezonancia eltétel, LUMINESZCENCIA - Lumineszcencia típuso gerjesztés szerint / emisszió mechanizmusa szerint - Fluoreszcencia és oszoreszcencia, szinglet/triplet állapot, energetia - Időbeliség, oherencia, polarizáltság - Irányüggés (divergencia), otoszeleció - Sávos színép és magyarázata, moleuláris energiarendszer Jablonsy termséma - Tüörszimmetria, Stoes-éle eltolódás - Élettartam, vantum hatáso Deiníció, törvénye Lumineszcencia FLUORIMÉTER - DETEKTÁLÁS - Fluoriméter elépítése: monoromátoro (gerjesztési, emissziós), merőleges elrendezés, PMT Alalmazáso - Belső / ülső luoroóro - Moleulá vizsgálata; dinamiai, statiai szempontból - Kölcsönhatáso vizsgálata További alalmazáso, módszere - övetező előadáso anyaga: - Anizotrópia lecsengés, FRET, luoreszcencia ioltás, - luoreszcens miroszópia alaptulajdonságo Szinglet/triplet állapot Energetia Időbeliség, oherencia Irány (divergencia) Polarizáltság A lumineszcencia típusai A gerjesztés módja szerint: EM sugárzás elnyelése (bio)émiai reació termiusan ativált eletromos töltés által induált nagy energiájú részecse v. sugárzás mechaniai (súrlódás) hanghullámo A gerjesztett állapot szerint: otolumineszcencia emi-, biolumineszcencia termolumineszcencia eletrolumineszcencia radiolumineszcencia tribolumineszcencia sonolumineszcencia szinglet szinglet átmenet luoreszcencia triplet szinglet átmenet oszoreszcencia A termolumineszcencia nem azonos sem a hő-, sem a eete test sugárzással! 0 Ene ergia Szinglet és triplet állapot (moleulá) Eredő spin? s = S =? Multiplicitás: = 2 S+ S = 0 M = S = M = 3 S Pauli elvne megelel engedélyezett átmenet Abszorpció T Pauli elvne ellentmond tiltott átmenet

0 a Energia Jabłonsy-éle termséma moleuláris rendszerre abszorpció ideje: 0-5 s S 2 S Abszorpció Emisszió.

De-excitáció excitáció Emisszió (ibocsátás) Energialeadás özben az e - egyi szintről a másira jut. Fotont bocsát i a rendszer.

0 En nergia Jabłonsy-éle termséma S 2 S Abszorpció Emisszió IC: internal conversion Belső onverzió VR: vibrációs relaxáció (termius relaxáció) ISC: intersystem crossing Rendszere özti átmenet

Sugárzásos átmenete (radiativ) Fluoreszcencia spetrum: tüörszimmetria, Stoes éle eltolódás ( ) Tüörszimmetria oa Int. : 0-9 0-6 s p : 0-6 0 s absz. gerj. luor. oszor.

2 0 a Energia Jabłonsy-éle termséma moleuláris rendszerre abszorpció ideje: 0-5 s S 2 S Abszorpció Emisszió. Excitáció (gerjesztés) Abszorpció (elnyelés) Energiaelvétel özben az e - egyi szintről a másira jut. Fotont nyel el a rendszer. 2. De-excitáció excitáció Emisszió (ibocsátás) Energialeadás özben az e - egyi szintről a másira jut. Fotont bocsát i a rendszer. Kasha szabály (luoreszcencia) Minden sugárzásos átmenet az első gerjesztett (S ) állapot legalsó vibrációs energiaszintjéről indul. 0 En nergia Jabłonsy-éle termséma S 2 S Abszorpció Emisszió IC: internal conversion Belső onverzió VR: vibrációs relaxáció (termius relaxáció) ISC: intersystem crossing Rendszere özti átmenet Sugárzás nélüli átmenete (nonradiativ) T luoreszcencia ( s) oszoreszcencia (0-6 0 s) SPONTÁN EMISSZIÓ! Sugárzásos átmenete (radiativ) Fluoreszcencia spetrum: tüörszimmetria, Stoes éle eltolódás ( ) Tüörszimmetria oa Int. : s p : s absz. gerj. luor. oszor. Az átmenete mindét esetben azonos szintről indulna és ülönböző vibrációs szinteen végződne. Source: ényorrás Hogyan mérjü a lumineszcenciát? Egy luoriméter műödéséne elméleti sémája gerjesztési monoromátor Minta Milyen idősálán zajlana a olyamato? gerjesztés Fluoreszcencia 0-9 s Foszoreszcencia 0-3 s Fény (gerjesztés) Fény (emisszió) Eletromos jel emissziós monoromátor Detetor Merőleges gerjesztési- emissziós elrendezés! Kiértéelés (PC) alapállapot 0-5 s relaxáció luoreszcencia ioltás, FRET gerjesztett állapot Belső átalaulás (Internal conversion, hő) 2

A luoreszcencia élettartam Fluoreszcencia lecsengési görbe I ( t ) I 0 e t A luoroóro araterisztius tulajdonsága, jele: (tau) Átlagos élettartam : sebességi állandó Fluoreszcencia élettartam ( ) A

ic ahol nr = ic + isc isc nr ns-os tartomány - a luoreszcencia-átmenet valószínűsége ic - internal conversion (belső onverzió) isc - intersystem crossing (rendszere özti átmenet) nr - nonradiativ

3 A luoreszcencia élettartam Fluoreszcencia lecsengési görbe I ( t ) I 0 e t A luoroóro araterisztius tulajdonsága, jele: (tau) Átlagos élettartam : sebességi állandó Fluoreszcencia élettartam ( ) A moleula gerjesztett állapotból otonemisszióval erül vissza alapállapotba. A luoreszcencia-élettartam az az idő, amely alatt a gerjesztett állapotban levő moleulá száma az e-ed részére csöen. ic ahol nr = ic + isc isc nr ns-os tartomány - a luoreszcencia-átmenet valószínűsége ic - internal conversion (belső onverzió) isc - intersystem crossing (rendszere özti átmenet) nr - nonradiativ (sugárzás nélüli átmenet) Fluoreszcencia vantumhatáso N Q N Q emit abs ic < isc ic isc Fluoroóro N emit és N abs nem, vagy csa nehezen mérhető, ellenben és mérhető! Fehérjé abszorpciója - aminosava A három ontos aminosav, amelye UV-ban abszorbálna, azaz gerjeszthető. Fluoroóro luoreszcenciára alalmas émiai anyago. Intrinsic, natív (belső) luoroóro Fehérjében: aromás aminosava Nem ell módosítani a vizsgált biológiai rendszert. extinc ció hullámhossz 3

Külső (extrinsic) luoroór alalmazásaor: maromoleula luoroór A romoór (luoroór) loális mozgása elülöníthető a moleula egészéne mozgásától.

Polarizált ény, abszorpciós vetor, eletromos vetor Eletromos dipolmomentum Eletromágneses hullám eletromos térerősség vetora, rezgési sí Kovalensen ötött luoroóro. Jelölt antiteste.

A metszősíot szemből nézve az alábbi ép tárul elén: Ha az eletromos térerősség vetora a tér valamely, a énysugár vonalában lévő, rögzített pontjában egy egyenes mentén rezeg, aor síban vagy

4 Külső (extrinsic) luoroór alalmazásaor: maromoleula luoroór A romoór (luoroór) loális mozgása elülöníthető a moleula egészéne mozgásától. Térszerezeti változás a maromoleulában hat a romoór mozgására is. Ez a változás mérhető. Polarizált ény, abszorpciós vetor, eletromos vetor Eletromos dipolmomentum Eletromágneses hullám eletromos térerősség vetora, rezgési sí Kovalensen ötött luoroóro. Jelölt antiteste. Egyéb émiai módosuláso. Síban ill. lineárisan polarizált ény Az animáció egy üggőleges síban polarizált hullámot mutat be. Síban ill. lineárisan polarizált ény Az alábbi animáció egy vízszintes síban polarizált hullámot mutat be. A metszősíot szemből nézve az alábbi ép tárul elén: Ha az eletromos térerősség vetora a tér valamely, a énysugár vonalában lévő, rögzített pontjában egy egyenes mentén rezeg, aor síban vagy lineárisan polarizált hullámról beszélün. A metszősíot szemből nézve Eletromos és abszorbciós vetoro Eletromos térerősség vetor Abszorbciós vetor meghatározza az abszorbció valószínűségét A úpon belüli abszorpciós vetor esetén a luoroor gerjesztéséne valőszínűsége nagyobb, mint 50%. (üggőleges polariáció esetén) orgásúp!!! Abszorpció maximális, ha az abszorpciós vetor és a ény eletromos térerősség vetora párhuzamos. Abszorpció épessége ügg cos 2 θ-tól (θ az absz. vetor és a ény eletromos térerősség vetora özötti szög). Fotoszeleció luorooro random orientációjú populációja izotróp: irányüggetlen Minden irányban azonos. polarizálatlan ény vertiálisan polarizált ény Véletlenszerű, izotróp eloszlás Anizotróp eloszlás otoszeleció = rendezett orientációjú szubpopuláció szeletálódi 4

Élő sejte saját luoreszcenciája Aequorea victoria GFP (green luorescent protein) szalagdiagrammja Extrinsic (ülső) luoroóro -

: cisztein, glutamin, lizin) A ehérje ativitását tesztelni ell.

oncentrációjú mintá esetén is). A luoreszcencia paramétere érzéenye a örnyezeti tényező megváltozására.

Biológiai rendszere vizsgálata. Moleulá özötti és moleulán belüli ölcsönhatáso tanulmányozása.

Moleulá rugalmasságána jellemzése (FRET).

5 Élő sejte saját luoreszcenciája Aequorea victoria GFP (green luorescent protein) szalagdiagrammja Extrinsic (ülső) luoroóro - luoreszcens estée A jelölő émiai anyago minősége és elhelyezedése tervezhető. A luoroóroat speciius ötőhelyehez öthetjü. (pl.: cisztein, glutamin, lizin) A ehérje ativitását tesztelni ell. IAF IAEDANS PIRÉN példá: IAEDANS-IAF: FRET donor-aceptor pár Pirén: atin polimerizáció luoreszcein, dansyl, rhodamine száramzéo... Atin monomer szalagdiagramja Fluoreszcencia alalmazási lehetőségei Előnyös tulajdonságai Jól detetálható jel (alacsony oncentrációjú mintá esetén is). A luoreszcencia paramétere érzéenye a örnyezeti tényező megváltozására. A moleuláris szintű vizsgálato ontos eszöze Szerezeti és dinamiai inormációt ad a vizsgált rendszerről. Biológiai rendszere vizsgálata. Moleulá özötti és moleulán belüli ölcsönhatáso tanulmányozása. Moleuláris mozgáso vizsgálata (polarizáció, anizotrópia). Moleuláris szintű távolságmérés (FRET). Moleulá rugalmasságána jellemzése (FRET). Moleula szerezeti részleteine, és az egyes csoporto elérhetőségéne eltérépezése (quenching). További alalmazáso: Szerezeti tulajdonságo vizsgálata Fehérje denaturáció nyomonövetése Protein-ligand apcsolat vizsgálata Szerezet vizsgálata a örnyezeti paramétere (Hi (ph, iono) változásána áá üggvényében éb Dinamius tulajdonságo vizsgálata Membránhoz ötött luoroóro anizotrópiája inormálhat a membrán belsejében lévő viszozitásról Fehérjéhez ötött luoroóro anizotrópiája inormálhat a ehérjemátrix lexibilitásáról 5

KIEGÉSZÍTÉS Emisszió típuso tulajdonságai Induált A beérező otonnal Egy időben (azonnal) oherens Egyező irányban (is divergencia) Azonos hullámhossz monoromatius LASER Spontán (a oton abszorpcióhoz

6 KIEGÉSZÍTÉS Emisszió típuso tulajdonságai Induált A beérező otonnal Egy időben (azonnal) oherens Egyező irányban (is divergencia) Azonos hullámhossz monoromatius LASER Spontán (a oton abszorpcióhoz épest) Időben ésleltetve nem oherens Minden irányban (3D) nem azonos nem monorom. Kisebb energiájú LUMINESZCENCIA I Az emisszió gerjesztési hullámhossztól való üggése Ha a megvilágító ény λ 2 (optimális gerjesztési hullámhossz), aor nagy mennyiségű gerjesztett eletront apun a so elnyelt oton öveteztében. Enne hatására nagy intenzitású emissziót apun ( széles spetrális tartományban. Ha a ény λ (nem optimális gerjesztési) hullámosszúságú, aor evesebb abszorbeált oton, evesebb gerjesztett eletront eredményez. Így alacsonyabb lesz az emisszió intenzitása.. DE! Az emisszió spetrálid eloszlása nem változi. magyarázat: valószínűség, Kasha szabály λ λ 2 λ (nm) 6

Hasonló dokumentumok

Lumineszcencia spektrometria összefoglaló

Lumineszcencia spektrometria összefoglaló Ismétlés: fény (elektromágneses sugárzás) elnyelés: abszorpció elektron gerjesztés: excitáció alap és gerjesztett állapot atomi energiaszintek, energiaszintek