Fluoreszcencia spektroszkópia

Átírás

1 Elektromágneses spektrum Fluoreszcencia spektroszkópia Ujfalusi Zoltán A fény: elektromágneses hullám Biofizika szeminárium PTE ÁOK Biofizikai Intézet február Lumineszcencia: a fényt kibocsátó rendszer nem a magas hőmérséklet miatt világít!!! Ez az ún. hideg emisszió jelensége. Molekulákból vagy ionokból: molekuláris lumineszcencia Alapjelenségeit a Jablonski-féle séma szerint értelmezzük. A lumineszcencia típusai 1. Kemilumineszcencia 2. Fotolumineszcencia 1. Kemilumineszcencia olyan fényemisszió, amelyhez szükséges gerjesztő energia adott kémiai reakció során felszabaduló energiából adódik pl.: foszfor (P) oxidáció útján való világítása alkalmas anyagcsere folyamatok vizsgálatára kis intenzitású fiziológiás viszonyoktól függő 1

2 Biolumineszcencia: a kemilumineszcencia egyik típusa, amikor a gerjesztő energiát biztosító kémiai reakció élő organizmusban játszódik le. pl.: szentjánosbogár, mélytengeri halak, medúzák, polipok, baktériumok, planktonok 2. Fotolumineszcencia olyan fényemisszió, amelyhez szükséges gerjesztő energia adott hullámhosszú (frekvenciájú, energiájú) fény besugárzásából adódik Energiaszintek alkalmas molekuláris rendszerek vizsgálatára, mert jelentős információt hordoz a molekula tulajdonságairól, kölcsönhatásairól, környezetével való kapcsolatáról Vibrációs szintek Első gerjesztett állapot Elektron 1. A luciferáz katalizálja a luciferin oxidációját. 2. Inaktív oxyluciferin és fény (h ) keletkezik. 3. A további luciferin a táplálékból vagy belső szintézisből pótlódik. Lumineszkáló molekulák szerkezete: konjugált kettős kötéseket tartalmazó gyűrűkkel rendelkeznek két típusa: fluoreszcencia, foszforeszcencia energia szintek Alapállapot Jablonski-féle termséma Energiaszintek (S 0, S 1...) felhasadnak vibrációs szintekre (atommagok rezgő mozgásából); minden vibrációs szint felhasad rotációs szintekre (atommagok tengely körüli forgásából) Kasha-szabály bizonyítéka: Bizonyíték: bármilyen hullámhosszú foton elnyelésével kerül a molekula gerjesztett állapotba, az emissziós spektrum alakja nem változik. Alap és gerjesztett állapot természetétől függően: Fluoreszcencia: a molekula szinglet gerjesztett állapotból relaxálódik a szinglet alapállapotba Foszforeszcencia: a molekula triplet gerjesztett állapotból relaxálódik a szinglet alapállapotba Megkülönböztetésük: - spektrumuk alakja, - gerjesztett állapot időtartama szerint. Az S 1 -S 0 átmenet A rendszer többféle úton adhatja le az energiát fény formájában: a. Fluoreszcencia Az elektron a termikus relaxáció után egy lépésben tér vissza az alapállapotba Lecsengése: nanoszekundumos (10-9 s) nagyságrendű b. Foszforeszcencia S 1 állapotú molekula sugárzás nélküli átmenettel T 1 triplett állapotba kerül ebből sugárzási energia kibocsátásával kerül S 0 alapállapotba (tiltott spinátmenet miatt kisebb valószínűséggel) Lecsengése: s c. Késleltetett fluoreszcencia T 1 állapotból termikus gerjesztéssel S 1 állapotba, majd onnan S 0 - ba ( magas hőmérsékletű foszforeszcencia ) 2

3 A lumineszkáló anyagot jellemzi: Abszorpciós spektruma, valamint fluoreszcencia, foszforeszcencia gerjesztési és emissziós spektruma Sugárzás kvantumhatásfoka A gerjesztési spektrum Egy rögzített emissziós hullámhosszon detektálunk. Az intenzitást a gerjesztési hullámhossz függvényében mérjük. Függvényalakja az abszorpciós spektruméval megegyezik. Gerjesztés Az emissziós spektrum A kisugárzott fény teljesítménysűrűségének hullámhossztól való függését kifejező függvény: ΔJ E / Δ λ (λ) Azt a sugárzási intenzitást jelöli, mely egy adott hullámhossz Δ λ környezetében mérhető. A Δ λ intervallumot a rés szélessége határozza meg. Gerjesztett állapot élettartama Emisszió polarizációfoka (anizotrópiája) Stokes-féle eltolódás, tükörkép spektrumok Sir George Gabriel Stokes, 1 st Baronet ( ) Fluoreszcencia emissziós spektrum Az első szinglett gerjesztett állapot legalsó vibrációs szintjéről az alapállapot valamely vibrációs szintjére való átmenetkor keletkezik. Információt ad az alapállapot vibrációs szintrendszeréről. Foszforeszcencia emissziós spektrum Kvantumhatásfok fluoreszcencia során kibocsátott és elnyelt fotonok számának hányadosa. = N emitt / N absz < 1 - kifejezhető a sebességi állandók hányadosaként is: Az első triplett gerjesztett állapotból a szinglett állapotba való átalakuláskor. Szobahőmérsékleten csak kristályos anyagokon. (oldatban: kioltók pl. O 2 ) A fluoreszcencia sávhoz képest a vörös felé eltolódott. = k f / (k f + k össz ) f fluoreszcencia össz f + vibr. + rot. (azaz f + non-radiatív) 3

4 Intenzitás Intenzitás Fluoreszcencia élettartam Az az időtartam, amely alatt a gerjesztett állapotban található molekulák száma e-ad részére csökken. Fluoreszcencia élettartam mérése idő-függő mérés ( time domain measurement ) Fluoreszcencia élettartam mérése frekvencia-függő mérés ( frequency domain measurement ) = 1 / (k f + k össz ) Intenzitás Idő (ns) Modulált gerjesztés (frekvencia ~20 / 80 MHz) Eltelt idő Fluoreszcencia élettartam mérése frekvencia-függő mérés ( frequency domain measurement ) Demoduláció Fáziseltolódás Fluoreszcens festékek natív vagy intrinsic fluorofórok: Triptofán, tirozin, fenilalanin Előnyük: Nem kell módosítani a fehérjét. Extrinsic (külső) fluorofórok Direkt jelölés festékekkel: IAEDANS IAF FITC Emisszió rövid élettartamé (pl. 1 ns) Emisszió hosszú élettartamé (pl. 10 ns) Modulált gerjesztés (50 MHz) Eltelt idő külső vagy extrinsic fluorofórok: Denzil, fluoreszcein, rodamin, kumarin, stb. Fluoreszcensen jelölt toxinokkal: Falloidin B-skorpiótoxin A-bungarotoxin Makrofágok Aktin jelölve falloidin-alexa 568-cal (Piros) Magok: DAPI (Kék) Streptococcus aureus (Zöld) 4

5 A fehérjék fluoreszcens jelölése - A jelölők minősége és elhelyezkedése tervezhető. - A fluorofórokat specifikus kötőhelyekhez kapcsoljuk. - Így a fehérje módosulhat, aktivitását tesztelni kell. Jelölés specifikus antitestekkel (immunfluoreszcens, immunhisztokémiai jelölés) Az antitest nagy affinitással és specifitással kötődik az általa felismert molekula felszínéhez (epitóp) Monoklonális és poliklonális antitestek Direkt jelölés: az antitesthez fluoreszcens festék van kötve Indirekt jelölés: az elődleges antitest jelöletlen, a másodlagos antitest van megjelölve Hogyan mérünk fluoreszcenciát? fényforrás ( steady-state eset) hullámhossz választás minta hullámhossz választás detektor A mérés alapelvei Legfontosabb probléma: a gerjesztő fény és az általa okozott lumineszcencia fény elkülönítése I. Fluoreszcencia mérésénél A gerjesztési és észlelési irányok célszerű megválasztása Három elrendezés II. Foszforeszcencia mérésénél A gerjesztő fény a foszforeszcencia fénytől időben elkülönüljön Az intenzitás időbeli változása is mérhető legyen Mindig alacsony hőmérsékleten kell mérni Foszforoszkóp alkalmazása: A mintát gerjesztés után optikai ernyővel eltakarjuk, ekkor juthat a detektorhoz az emittált fény. Az az idő, amely a gerjesztés befejezése és a megfigyelés kezdete között eltelik függ: a forgási sebességtől a nyílások számától Gyakorlatilag elérhető legrövidebb idő: 10-5 s nagyságrendű 5

6 A foszforoszkóp A forgó átlátszatlan henger résén a gerjesztő fény áthatol, de a foszforeszcencia a henger falán nem jut át Negyedfordulat után a gerjesztő fény útja záródik el, a foszforeszcencia a detektorhoz jut a henger másik részén A minta Általában oldat (fehérje, nukleinsav, pigment extraktum, sejtszuszpenzió) A küvetta anyaga ne fluoreszkáljon! Üvegküvetta (látható tartomány) Speciális üvegküvetta (λ > 300 nm) Műanyag küvetta Speciális kvarcküvetta (fluoreszcencia mérésre) Küvetta tartó berendezések: Temperálható (több féle módon) Több (ált. 4) minta, forgatható Gerjesztő fényforrások A mesterséges fényforrások által kibocsátott fény lehet: Folytonos-, (magas hőmérsékletre hevített anyag) Halogéntöltésű izzószálas lámpák. Nagy nyomású gázokkal töltött lámpák. Vonalas-, (atomok) Intenzív, monokromatikus fény állítható elő. Alacsony nyomású higanygőzzel töltött gázkisülési cső. Stb. Optikai szűrők Szelektivitás bizonyos hullámhosszúságú fényre Abszorpciós filterek Általában üvegből készülnek. Szerves vagy szervetlen összetevőket tartalmaznak, emiatt bizonyos hullámhosszúságú fénysugarakat átengednek, míg másokat nem. Műanyag (olcsóbb, könnyebb) Dikroikus tükrök Optikai szűrők Ultraibolya (UV) filterek: Az ultraibolya-fényt nem engedik át, de hosszabb hullámhosszúakat igen. Neutrális szűrők: Transzmissziójuk széles színképtartományban a hullámhosszúságtól független. A gerjesztő fény intenzitásától függő fotokémiai, fotobiológiai folyamatok tanulmányozhatók. Interferencia szűrők: Akkor használjuk, ha a folytonos színképű fényből viszonylag keskeny sávot akarunk kiválasztani. Vonalas színképű gerjesztő fényből meghatározott hullámhosszúságnál fellépő vonalat kell elkülönítenünk. Áteresztőképességük a beeső fény beesési szögétől függ. Optikai szűrők Longpass-filterek (Felüláteresztő szűrők) Magasabb hullámhosszú fénysugarakat enged át. Általában éles csúcs jellemzi őket. Fluoreszcens mikroszkópiában a dikroikus tükrök emissziós filterekként használatosak. Shortpass filterek (Aluláteresztő szűrők) Optikai interferencia vagy színezett üveg filterek. Rövidebb hullámhosszú fénysugarakat enged át. Dikroikus tükrök excitációs filterek-ként használatosak. Bandpass filterek (Sáv szűrők) Előző kettő kombinációja. Általában alacsonyabb transzmittancia-érték mint az előzőeknél. A kiválasztott intervallumon kívül teljesen blokkol minden más hullámhosszú fényt. 6

7 Optikai szűrők Polarizációs filterek (Polarizátorok) A beeső fény polarizációja alapján szűrnek A: Fényforrás B: Rés C: Kollimátor D: Prizma vagy rács E: Tükör F: Excitációs rés G: Minta Monokromátorok A detektor Fotoelektron-sokszorozó cső (Photomultiplier tube) Nagyon szenzitív érzékelők az ultraibolyától a közeli infravörös tartományig. A fluoreszcencia alkalmazásának előnyei: - jó detektálhatóság: kis koncentrációban is jól mérhető - a fluoreszcencia érzékeny a környezetre 7