Polarizált fény, polarizáció. Polarizáció fogalma. A polarizált fény. Síkban polarizált fény. A polarizátor

Átírás

1 Polariált fén, polariáció PÉCSI TUDOMÁNYGYTM ÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNYI KAR Fluorescencia aniotrópia, FRT Megjelenés fotóáskor! Nitrai Miklós, 2015 február 10. Miért van ilen hatása? Polariáció fogalma A polariált fén A elektromágneses sugárás elektromos (és mágneses) térerõsségének vektora meghatároott görbe mentén moog (térbeli iránultság!). lektromágneses hullámok terjedése Ha a görbe egenes: lineáris v. sík polariáció Ha a görbe kör: cirkuláris polariáció (Ha a görbe elipsis: elliptikus polariáció) A polariálatlan fénben a polariációs síkok keverednek. A polariált fénben a polariációs síkok össhangban vannak (aonosak). A fén transverális elektromágneses hullám. Síkban polariált fén A polariátor Definíció: A polariátor eg olan eskö mel képes a polariálatlan elektromágneses sugárást (fén) olan sugárássá alakítani, melben csak egféle polariációs sík van jelen. 1

2 Polariátor m/ködésének elve Hol találkotunk már polariátorral? Korábbi ismereteink: pl. optikai aktivitás Polariáció, intenitások Optikai aktivitás: poláros fén síkját elforgatják Intenitás eg adott iránban: α = α λ lc Fénforrás t Θ Ι = Ι ma cos 2 Θ polariátor Polariátor Párhuamos állás: Θ = 0, I = Ima Mintatartó Merõleges állás: Analiátor Θ = 90, I = 0 Megfigelõ királis molekulák Polariméter nem kell gerjesteni! A absorpciós vektor fogalma Fotoselekció MA = absorpciós vektor Nincs absorpció (θ= 90o) θa gerjestés Maimális absorpció (θ= 0o) θa Absorpció ~ cos2 θa (ma=1) absorpciós vektor: megsabja a foton absorpciójának valósín7ségét. 2

3 Mi történik a fotoselekciót követõen? A fotoselekció eredméne r Mogás: r - transláció; - rotáció. Minderre τ idõ van! A emissiós vektor Hogan jellemehetõ e a rotációs mogás? M = emissiós vektor IZ gerjestés θ Detektor emissiós vektor: megsabja a foton emissiójának valósín7ségét. Meg kell mondanunk, mekkorát csökken a komponens! A spektrofluorométer felépítése fénforrás gerjestési monokromátor F M IZ vs. Isum = IZ + + IZ θ (A teljes intenitásho tudjuk visonítani.) P 90o S P M emissiós monokromátor D detektor Vag vertikálisan, vag horiontálisan heleük el a polariátorokat: IVV IVH IHV IHH mintatartó Polariátorokat alkalmaunk!!! 3

4 Íg a teljes intenitás: Isum = IZ + + IZ θ Isum = IVV + IVH + IVH Fluorescencia polariáció Isum = IVV + 2IVH Fluorescencia polariáció p = (IVV - GIVH) / (IVV + GIVH) p = (IVV - GIVH) / (IVV + GIVH) dimenió nélküli Ha τ = 0 lenne: IVV ma., IVH = 0, tehát p = 1. G = IHV / IHH Ha τ nagon hossú lenne: IVV = IVH, tehát p = 0. nem függ a fluorofór koncentrációjától a fluorofór rotációs diffúiós mogása befolásolja nem additív!!! De nem additív!!! értéke 0-tól 1-ig váltohat (ld. követkeõ dia). missiós aniotrópia missiós aniotrópia r = (IVV - GIVH) / (IVV + 2GIVH) dimenió nélküli G = IHV / IHH nem függ a fluorofór koncentrációjától a fluorofór rotációs diffúiós mogása befolásolja Isum = IZ + + additív!!! mlékeünk! Isum = IVV + IVH + IVH Isum = IVV + 2IVH 4

5 Mitõl függ a aniotrópia értéke? Mint láttuk, rotációs mogást ír le! A rotációs mogás gorsaságától; rotációs diffúió; IZ Polariált fén A rendelkeésre álló idõtõl; fluorescencia élettartam! τ θ IZ θ Résben polariált fén Rotációs diffúió A aniotrópia idõfüggése r A aniotrópia jelentése és alkalmaásai a fehérjék és molekulák forgásáról, rotációjáról tájékotat molekulák kötõdését tudja leírni éréken a molekulákon belüli konformációs váltoásokra a fehérjék rugalmasságát is méri alkalmas biológiai membránok tanulmánoására I(t) = I0 e t / τ r (t ) = r0 ai ep( t / θ ) t Mire emléketet a idõfüggés? Távolságmérés a molekulákban Távolságmérés a molekulákban Fluorescencia Reonancia nergiatransfer De hogan? (FRT) 5

6 mléketetõ gerjestési energia fluorescencia fosforescencia 10-9 s 10-3 s Fluorescencia reonancia energiatransfer (FRT) - Theodor Förster, 1948 gerjestés s alapállapot relaáció fl. kioltás FRT gerjestett állapot belsõ konverió (hõ) A fluorescencia vag Förster típusú energiatransfer a gerjestett állapotban lévõ molekula (donor), valamint eg megfelelõ spektroskópiai követelméneket kielégítõ molekula (akceptor) köött dipól-dipól kölcsönhatás révén, sugárás nélküli energiaátadás formájában jön létre. Hogan kell érteni a dipól-dipól kölcsönhatást? A FRT létrejöttének feltételei Apoláris molekula: ha a molekulán belül a töltéseloslás egenletes Poláris molekula: ha a molekulán belül a töltéseloslás nem egenletes (a poitív és negatív töltések köéppontja nem esik egbe ) Dipólus-molekula: a két pólussal rendelkeõ (poláros) molekula. Fluorescens donor molekula. A donor és akceptor molekulák alkalmas orientációja. Átfedés a donor emissiós spektruma és a akceptor absorpciós spektruma köött. Megfelelõ távolságtartomán: a donor és akceptor molekula köötti távolság (R) 2-10 nm! Mit értünk itt spektrális átfedésen? FRT A gerjestett donor relaációja a akceptor molekulának történõ energiaátadással! hνg D + hνd kt ~ 1/R6 R A hνa + A FRT Jablonskisémája 6

7 A FRT hatásfoka Hogan lehet vele távolságot mérni? = 1 (FDA / FD) ahol FDA: a donor intenitása akceptor mellett; FD : a donor intenitása akceptor nélkül. Sámolható élettartamokkal is! = 1 (τda / τd) A Förster-féle kritikus távolság: R0 A Förster-féle kritikus távolság a a donor-akceptor távolság, ahol a FRT hatásfoka 0.5 (50 %). A FRT hatásfokának távolságfüggése = Tipikus értékek: Donor Akceptor Ro (Å) Fluorescein Tetramethlrhodamine 55 IADANS Fluorescein 46 DANS Dabcl 33 Fluorescein Fluorescein 44 BODIPY FL BODIPY FL 57 Fluorescein QSY 7 and QSY 9 des 61 R06 R06 + R 6 Alkalmaható távolságmérésre! Molekuláris mérősalag! A FRT hatásfokának távolságfüggése Alkalmaások Serkeeti tulajdonságok visgálata Fehérje denaturáció nomonkövetése Protein-ligand kölcsönhatás visgálata Serkeet visgálata a körneeti paraméterek (ph, ionok) váltoásának függvénében Dinamikus tulajdonságok visgálata Membránho kötött fluorofórok aniotrópiája informálhat a membrán belsejében lévõ viskoitásról Fehérjékhe kötött fluorofórok aniotrópiája informálhat a fehérjemátri fleibilitásáról 7

8 Hogan mérjünk FRT távolságokat? Példa alkalmaásra: 9-Anthrolnitrile kötése a mioin S1-he 1. Válassuk ki a megfelelõ fluorofór párt! 12 serinbõl 1 jelölhetõ fluorofórral a mioin S1-en belül 2. Mérjünk meg a intenitásokat! 3. Sámoljuk ki a FRT hatásfokot! 4. Határouk meg a távolságot!? Melik? 9-anthrolnitrile (ANN) kötése a mioin S1-he ANN kötése a mioin S1-he ANN-el potenciálisan jelölhetõ 12 db serin aminosav (donor) Akceptorral jelölhetõ, ismert poíciójú aminosavak A Ser-181-he kapcsolódott a fluorofór! A léneg Kösönöm a figelmet! - a polariált fén fogalma; - a fotoselekció; - a fluorescencia aniotrópia; - a FRT; - alkalmaások. 8