In Situ Hibridizáció a pathologiai diagnosztikában és ami mögötte van.

Átírás

1 In Situ Hibridizáció a pathologiai diagnosztikában és ami mögötte van. Kneif Józsefné PTE KK Pathologiai Intézet Budapest

2 Kromoszóma rendellenesség kimutatás PCR technika: izolált nukleinsavak (RNS, DNS), morfológia nélkül Konvenciónális citogenetika: metafázis tenyésztés, kromoszóma preparátum In situ hibridizáció (ISH): gén lokalizációja, aktivításának feltérképezése Interfázis citogenetika (IPC): interfázisban lévő sejtek in situ hibridizációval történő vizsgálata

3 ISH-IPC alkalmazása, diagnosztikai jelentősége Számbeli kromoszóma eltérések azonosítása Diploid Pszeudodiploid Aneuploid hiperdiploid hipodiploid Strukturális kromoszóma rendellenességek kimutatása Deléció Inszerció Inverzió Transzlokáció Diagnózis megerősítése Genotípus szerinti identifikálás Szubtípusba való besorolás Prognosztikai és terápiás faktor Reziduális betegség nyomonkövetése

4 In Situ Hibridizáció elve Komplementaritás másodlagos kötések (H-híd kötés) Denaturáció kötések felszakíthatók hővel, kémiai anyagok Renaturáció eredeti szerkezet visszaalakulása

5 Olvadási hőmérséklet Tm=81,5+0,41x(%GC)+16,6log(Na + )-0,63x (%formamid)- ( X(Na + )/d %GC= guanin+citozin arány (Na + )= nátrium ion molaritása (%formamid=formamid %-os aránya d= kettösszálú DNS fragmenthossza

6 Hibridizációt befolyásoló tényezők Hőmérséklet Formamid koncentráció Monovalens kation (Na + ) DNS fragmentumok hossza ph Próba koncentráció Dextrán-szulfát Bázispár mismatch

7 Alkalmazott DNS próbák lokalizációja

8 ISH általános metodikája Preparátum készítés Fixálás - p.vér, cs.velői sejtek, lenyomati preparátum, fagyasztott metszet, formalim fixált paraffinos blokkból metszet - struktúra rögzítés (70% EtOH, Carnoy, formalin)

9 Paraffinos metszet készítés trunkációs effektus A hibridizálás vastag metszeten történik, a kiértékelés konfokális pásztázó lézermikroszkóppal Paraffinos blokkból magszuszpenzió, majd citológiai preparátum készül Részleges információ vesztés, morfológia megtartása

10 ISH általános metodikája Preparátum készítés Fixálás Előkezelés - p.vér, cs.velői sejtek, lenyomati preparátum, fagyasztott metszet, formalim fixált paraffinos blokkból metszet - struktúra rögzítés (70% EtOH, Carnoy, formalin) - proteáz emésztés (Proteináz K, pepszin, mikrohullám, vízfürdő)

11 DNS szerkezete

12 ISH általános metodikája Preparátum készítés Fixálás Előkezelés Denaturálás Hibridizálás Poszthibridizációs mosás - p.vér, cs.velői sejtek, lenyomati preparátum, fagyasztott metszet, formalim fixált paraffinos blokkból metszet - struktúra rögzítés (70% EtOH, Carnoy, formalin) - proteáz emésztés (Proteináz K, pepszin, mikrohullám), feltárás C közt C közt, 4-16 órán keresztül - háttérzaj csökkentése, aspecifikus kötődések eltávolítása

13 Tm=81,5+0,41x(%GC)+16,6log(Na + )-0,63x (%formamid)- ( X(Na + )/d %GC= guanin+citozin arány (Na + )= nátrium ion molaritása (%formamid=formamid %-os aránya d= kettösszálú DNS fragmenthossza

14 ISH általános metodikája Preparátum készítés Fixálás Előkezelés Denaturálás Hibridizálás - p.vér, cs.velői sejtek, lenyomati preparátum, paraffinos blokk, metszet - struktúra rögzítés (70% EtOH, Carnoy, formalin) -proteáz emésztés (Proteináz K, pepszin, mikrohullám) C közt C közt, 4-16 órán keresztül Poszthibridizációs mosás - háttérzaj csökkentése, aspecifikus kötődések eltávolítása Hibridek láthatóvá tétele direkt jelölt próba indirekt jelölt nukleotidok Mikroszkópia - fluoreszcens - izotóppal - fluorokrommal, - enzimmel - fény-, vagy fluoreszcens

15 Számbeli kromoszóma eltérések vizsgálata Centromer-specifikus Diploid Pszeudodiploid Aneuploid hiperdiploid hipodiploid FITC, Rhodamin, Gold, Aqua Ismétlődő szekvenciákhoz kapcsolódó próbák alkalmazása

16 Lókusz-specifikus próbák Egyedi szekvenciákhoz kapcsolódnak. Alkalmazás: strukturális eltérések kimutatásához Amplifikáció Deléció Inverzió Transzlokáció

17 Transzlokáció jelenlétének kimutatása

18 Értékelés

19 FISH Kromoszóma preparátumon. G-sávozás t(8;21)

20 ISH alkalmazások CEP-t(BCR-ABL) transzlokáció Biotinnal jelölt próba SABC-PO DAB

21 ISH Formalin fixált paraffinos metszeten

22 ISH Formalin fixált paraffinos metszeten

23 Vírus kimutatás in situ hibridizációval Epstein-Barr vírus - (EBER) Humán papillóma vírus (HPV)

24 Összefoglalás ISH-IPC kromoszóma rendellenesség kimutatására alkalmas rutindiagnosztikai vizsgáló módszer. Célkérdésekre ad választ. Az ISH metodika során bizonyos lépések egyedi beállítást igényelnek. A módszert befolyásoló paraméterek változtatásával lehetőség adódik a patológiában előforduló különböző típusú minták vizsgálatára. Az így kimutatott citogenetikai eltéréseknek a klinikai gyakorlat számára diagnosztikai, prognosztikai és terápiás jelentőséggel bírnak.

25 Köszönöm a figyelmet!