Bajtay Zsuzsa

Átírás

1 Immunológia II GY Bajtay Zsuzsa

2 4. Antigén-ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló jelöléses módszerek ELISA, ELISPOT, Western blot, Immunhisztokémia

3 Antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapuló módszerek 1. Antigén-ellenanyag kapcsolódást követő másodlagos reakciók kimutatásán alapuló technikák Az antigén és az ellenanyag tulajdonságai (valencia, flexibilitás, affinitás) határozzák meg a másodlagos reakciót, ami (szabad szemmel látható) csapadékképződés, agglutináció stb. lehet 2. Antigén-ellenanyag kapcsolódás kimutatása jelöléses technikával (érzékenyebb = kisebb antigén mennyiség mutatható ki) Antigén-ellenanyag specifikus kapcsolódás megtörténik, de ezt nem követi másodlagos reakció. Közvetlenül az ag-ea kapcsolódást mutatjuk ki azáltal, hogy valamelyik komponenst megjelöljük, ezáltal detektálni tudjuk

4 Jelölés Mivel jelöljük az ellenanyagot Példa Mit detektálunk Milyen módszerben használjuk Enzim HRPO, AP Enzim reakció ELISA, ELISPOT, Western blot, immunhisztokémia Fluoreszcens festék FITC, PE, Alexa,... Fluoreszcencia FACS, fluoreszcens mikroszkópia Fémkolloid arany, vas A fém tulajdonságait MACS, elektronmikroszkóp Radioaktív izotóp pl. 125 I Radioaktiv sugárzást RIA

5 Jelöléses mérési technikák elve + minta kimutatandó antigén antigén specifikus ellenanyag - Enzimmel konjugálva feleslegben alkalmazva specifikus antigén-ellenanyag kapcsolódás jelölt ellenanyag szabadon is jelen van az ellenanyag kötődése nem okoz látható változást ( másodlagos reakción alapuló technikák) Megoldás: szilárd felszínhez kötöm a reakciót így a szabad és az antigénhez kötődött jelölt ellenanyag komponensek elválaszthatók

6 2.2 ábra Antigén felismerés 1. Nem minden ellenanyag jó minden módszerhez 2. Az ellenanyag is lehet antigén jelölés

7 ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay Oldatban lévő anyagot detektálunk oldatban lévő ellenanyagok segítségével mikrotitráló lemezen a műanyag felszínhez kötődik az antigén/ellenanyag (= 96 lyukú PS plate) érzékenység < 0,0001 µg/ml Detektálás: spektrofotometria (de alapvetően enzimreakciót detektálunk!) Kvalitatív/kvantitatív E + SZ K K Az enzimreakciót az enzim denaturálásával állítjuk le (H 2 SO 4 ) E enzim (pl. HRPO) SZ szubsztrát (H 2 O 2 ) K kromogén (pl. TMB) Az átalakult szubsztrát hatására a kromogén színe megváltozik, ezt fogjuk spektrofotometriával detektálni (enzim és szubsztrát színtelen!)

8 Jelöléses mérési technikák elve Direkt jelölés Indirekt jelölés Avidin-biotin jelölés direkt

9 ELISA több antigén (mérendő) több enzimmel jelölt ellenanyag erősebb enzimaktivitás több átalakított szubsztrát kromogén erősebb színreakció

10 ELISA Ellenanyag jelöléshez leggyakrabban alkalmazott enzin és szubsztrátja: Enzim Szubsztrát Tormaperoxidáz / HRPO hidrogén-peroxid, H 2 O 2 Alkalikus foszfatáz p-nitrofenil-foszfát, pnpp

11 ELISA Leggyakrabban alkalmazott kromogének: Kromogén Színreakció Spektrofotometria TMB 3,3,5,5-Tetrametil-benzidin OPD o-feniléndiamin Karcinogén! ABTS 2,2'-azino-bisz-3-etilbenzotiazolin-6- szulfonsav DAB 3 3-diaminobenzidin-tetrahidroklorid Karcinogén! színtelen kék színtelen rozsda színtelen kékeszöld színtelen barna 450 nm 492 nm 405 nm 352 nm

12 ELISA lépései Coatolás (fedés) antigénnel vagy ellenanyaggal aspecifikus kötődés az antigén/ellenanyag és a műanyag felszín között (hidrofób kölcsönhatás) olyan oldatban, amely elősegíti a hidrofób részek felszínre kerülését (0,1 M NaHCO 3 puffer, ph 9,6) fehérjék, nukleinsavak, poliszacharidok, vírusok, baktériumok, sejtek kimutatása

13 Blokkolás A szabadon maradt műanyag felszínt (szabad kötőhelyeket) egy indifferens fehérje + detergens (pl. BSA bovine serum albumin + Tween) blokkoljuk, hogy az ELISA további rétegei ne kötődhessenek már aspecifikusan, csak a specifikus antigén-ellenanyag kapcsolatokon keresztül. (az ELISA további rétegeihez is detergens tartalmú oldatot használunk)

14 Direkt ELISA *minden lépésnél lemossuk a nem kötődött anyagokat 1. coatolás a kimutatandó antigénnel 4. Az antigénre specifikus, enzimmel kapcsolt ellenanyag hozzáadása 2. A nem kötődő antigén lemosása * 5. Az enzim szubsztrátjának és a kromogénnek hozzáadása, mely színt változtat az enzimmel való reakció hatására leállítás fotometrálás 3. szabad kötőhelyek blokkolása kötődött antigén kötődött, specifikus enzimmel jelölt ellenanyag enzimaktivitás Ligandum + kromogén színreakció

15 Indirekt ELISA Indirekt = a kimutatandó antigén és az enzimmel kapcsolt ellenanyag nem közvetlenül reagál egymással antigén antigén specifikus ellenanyag (jelöletlen) másodlagos (szekunder), enzimmel kapcsolt ellenanyag Másodlagos (szekunder) ellenanyagok: más fajú ellenanyagok konstans részére specifikus ellenanyagok pl. patkányban termeltetett anti-egér ellenanyag (= MINDEN egér ellenanyagot felismer, izotípustól függetlenül), vagy patkány anti-egér IgG (=MINDEN egér IgG-t felismer, de pl. IgM-et nem), stb.

16 Szendvics ELISA + kromogén 1. Coat készítés elsődleges ellenanyag szilárd fázishoz kötődik 2. antigén (ismeretlen konc.) (fehérjék, nukleinsavak, poliszacharidok, vírusok, baktériumok, sejtek) Standard: ismert koncentrációjú antigén hígításai kvantitatív meghatározáshoz szükséges 3. Antigén secifikus második allanyag jelzett (-HRPO) formában (biotin-sztreptavidin=erősíti a színreakciót, ld. ábra) 4. Szubsztrát (H 2 O 2 ) + kromogén (pl. TMB) A redukált (színtelen) TMB kromogén oxidálódik színváltozás (kék) 5. Reakció leállítása (H 2 SO 4 ) színváltozás (sárga) 6. Spektrofotometriás mérés Az első réteg után blokkolás (szabad kötőhelyek fedése), a további lépések között mosás (nem kötődött molekulák eltávolítása)

17 Gyakorlati kivitelezés Minél több lépcső, annál nagyobb jelerősítés keresztreakciók lehetősége is nő a biotin-avidin kapcsolat is használható jelerősítésre HRPO b avidin HRPO HRPO szendvics ELISA a legérzékenyebb, ezzel pl. hormonok, citokinek is kimutathatók, pontos koncentrációjuk is megadható, ha egy ismert koncentrációjú standard sort is lemérek az adott anyagból

18 OD (optikai denzitás) Koncentráció mérés A mérendő anyag ismert koncentrációjú oldata Ebből hígítási sort készítünk Egy koncentráció tartományban lineáris összefüggés a koncentráció és az optikai denzitás (enzimreakció mértéke) között CSAK ebben a koncentráció tartományban használható koncentráció mérésre

19 ELISPOT lemez Ellenanyagtermelő B sejtek kimutatása B sejtek tenyésztése antigénnel fedett edényben Limfokintermelő T sejtek kimutatása A T sejtel tenyésztése a kérdéses limfokinre specifikus ellenanyaggal fedett edényben ELISPOT technika filter mosás mosás Enzimmel konjugált anti-ig-vel való inkubálás A limfokinnek egy másik epitopját felismerő, enzimmel konjugált ellenanyaggal való inkubálás mosás mosás Kromogén hozzáadása Kromogén hozzáadása pozitív sejtek megszámolása

20 ELISA ELISPOT különbség ELISA A termelt anyag mennyiségét nézi ELISPOT Az anyagot termelő sejtek számát méri

21 Western blot (immunoblot) fehérje szelektív kimutatása fehérje keverékből specifikus ellenanyag segítségével kvantitatív meghatározásra nem alkalmas, mindig csak relatív különbségek detektálhatók lehet direkt vagy indirekt egyszerre több, nem azonos méretű fehérje is kimutatható 1. SDS-PAGE (SDS PoliAkrilamid GélElektroforézis) SDS = Na-dodecil-szulfát, letekeri és negatív töltéssel látja el a fehérjéket vándorlásuk csak a méretüktől függ - A negatív tötlésű fehérjék a pozitív pólus felé vándorolnak méretüktől függő sebességgel +

22 Western blot fehérjék megfestése a gélben lgelelect/acrylgel2.html s/simmons/technical-definition.html Fehérjék azonosítása molekulasúly alapján vagy transzfer nitrocellulóz membránra, immobilizáljuk a fehérjéket (=Western blot)

23 B Western blot 2. Minták átblottolása nitrocellulóz membránra Elektromos erőtérben vándoroltatjuk a még mindig negatív töltésű fehérjéket, csak az előző irányra merőlegesen minden fehérje azon a helyen marad, mint ahol a gélben volt, csak átkerül a nitrocellulóz filterre A szeparáló gél minták szeparálása gélben minták blottolás peptidek transzferálása nitrocellulózra (blot) szeparált peptidek blot immunofestése Immunológiai módszerek 4.8 ábra jelölt ellenanyag hozzáadása előhívás megfuttatott fehérjék a gélben megfuttatott fehérjék a membránon

24 2. A keresett fehérje specifikus kimutatása Western blot Lépések teljesen hasonlóak az ELISA-hoz: blokkoljuk a szabad nitrocellulóz felszínt közvetlenül enzimmel (HRPO) kapcsolt antigén specifikus ellenanyaggal inkubáljuk a membránt direkt jelölés Az antigénre specifikus jelöletlen/biotinnal jelölt ellenanyaggal inkubáljuk a membránt és ezután egy HRPO kapcsolt másodlagos ellenanyaggal vagy avidin-hrpo-val indirekt jelölés (jelerősítés!) előhívás: lumineszcens (fény kibocsátás) vagy kromogén szubsztráttal ges/sds_western_blot_proprep.jpg

25 minták szeparálása gélben minták peptidek transzferálása nitrocellulózra (blot) Western blot 3. Eredmény szeparált peptidek A bloton csak az ellenanyag által felismert fehérjék fognak jelet adni blot immunofestése jelölt ellenanyag hozzáadása Immunológiai módszerek 4.8 ábra B M előhívás A B C Aggregált C3 Példa: A vizsgált fehérje monomer és dimer formában is előfordul a sejtekben Kérdés: Az A, B és C sejttípusok közül melyik tartalmazza a monomer formát? Western blot alapján, a B sejttípusban nincs meg ez a forma (nincs jel) 200kDa C , ,5 Mert több azonos molekulatömegű fehérje is lehet a mintában, ezért az SDS-PAGE félrevezethet lánc lánc Ha tudom mekkora a fehérje mérete, miért nem elég az SDS-PAGE?

26 Pa painos hasítás term ékei Pep szines hasítá s te rmékei IgG enzimatikus hasítása, a termékek ellenőrzése SDS-PAGE-val Ms /kda Ms /redukált IgG /25 IgA 170 IgM /25 H ne héz lánc L 25 könnyű lánc Fab F(ab ) Fab Fab (Fab') 2 Fc pfc' pfc 26 Fc'

27 Immunhisztokémia (IHC) Szöveti antigének kimutatása metszet előállítása (beágyazás, fagyasztás, stb...) szövet feltárása, fixálás kritikus lépés, antigéndeterminánsok megtartása a cél Jelölési lépések ezután az ELISA-hoz és a Western blothoz hasonlóak Ugyanabban a mintában egyszerre több antigén is jelölhető Lehet direkt/indirekt, de ritkább a direkt a jelerősítés miatt Poliklonális ellenanyagok előnye

28 Immunhisztokémia (IHC)

29 Immunhisztokémia (IHC)