Szedimentáció, Elektroforézis. Kollár Veronika

HTML
DOWNLOAD

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Szedimentáció, Elektroforézis. Kollár Veronika"

Valéria Mezeiné
6 évvel ezelőtt
Látták:

1 Szedimentáció, Elektroforézis Kollár Veronika

2 Makromolekulák analízise és elválasztása

3 Szedimentáció Miért van szükség centrifugálásra? A nehézségi erıtérben való ülepítés a 2-50 µm tartományban alkalmazható, az ennél kisebb részecskék ülepítéséhez a gravitációs erıtér nem elegendı, ezért centrifugális erıteret kell alkalmazni. Theodor Svedberg 1920-as években megalkotta az elsı ultracentrifugát (N>10000 min -1 ) Ultracentrifuga Preparatív Analitikai Különbözı mérető ill. moláris tömegő komponensek elkülönítése méret vagy a moláris tömeg meghatározása

4 Szedimentáció Koncentráció eloszlás viszonyok az UC cellájában Milyen erık hatnak a centrifugában lévı részecskére?

5 Szedimentáció Meddig gyorsul a részecske? ρ,m F s =F c -F f A centrifugális erı és a felhajtóerı különbsége addig mozgatja a részecskéket gyorsuló mozgással a tengelytıl kifelé, amíg (a sebesség növekedésével) az ellenkezı irányú súrlódási erıvel egyensúlyba nem kerül.

Szedimentációs sebességi módszer Erıegyensúly esetén: F c + Ff + Fs = 0 = 2 m 2 = 2 ρ ρ ω ω 0 fv mrω 0r mr 1 ρ ρ Ezután a részecske sebessége már csak olyan arányba nı, ahogy távolodik

6 Szedimentációs sebességi módszer Erıegyensúly esetén: F c + Ff + Fs = 0 = 2 m 2 = 2 ρ ρ ω ω 0 fv mrω 0r mr 1 ρ ρ Ezután a részecske sebessége már csak olyan arányba nı, ahogy távolodik a forgástengelytıl. Az erık kiegyenlítıdése után a sebesség nem lesz konstans, mert a térerı helyfüggı. F s = F c F f S = v 2 rω = m 1 f ρ0 ρ Szedimentációs állandó: S 1 Svedberg=10-13 s

7 Mire jó? Meghatározhatom a részecske/molekula tömegét Ha meghatározzuk a sebességet (v) és a centrifugális gyorsulást (rω 2 ), akkor a részecske tömege számolható: Ehhez tudnom kell az f alakfaktort, de D diffúziós állandó k - Boltzmann állandó R - egyetemes gázállandó N - Avogadro-szám 6*10 23 A tömeg meghatározásához a szedimentációs sebességi módszert kombinálni kell diffúziós mérésekkel. Meghatározhatom a részecske/molekula alakját

8 Szedimentációs egyensúlyi módszer Ha a részecskék elérik a csı falát, egyensúly áll be, a nettó sebesség nulla lesz; Ha csak a centrifugális erı hatnak a molekulák a legkisebb energiájú helyen (az edény alján) helyezkednének el. DE! A mikroszkópikus mozgások folytatódnak A csı falának közelében kialakul a részecskéknek egy eloszlása. A tengelytıl mért két különbözı r1, illetve r2 távolságban az n1 és n2 molekulakoncentráció arányát a Bolztmann-eloszlásból kapjuk meg: E-helyzeti energia

9 Az energiák különbsége felírható Adott kísérletben az r1 és r2 pozíciók energiájának a különbségét a rotor szögsebessége határozza meg. A molekulák annál szőkebb r intervallumban helyezkednek el,,minél nagyobb a rotor szögsebessége. Szedimentációs egyensúly létrejön Vesszük a ln-t

10 A kapott egyenletbıl a tömeg kiszámolható! A módszer elınye a szedimentációs sebességi módszerhez képest: Az eredmények nem függenek az alaki faktortól Egy probléma lehet: sőrőség meghatározása Sőrőség grádiens ultracentrifugálás

Sőrőség grádiens ultracentrifugálás Nagy sőrőségő, de kis molekulatömegő anyagok centrifugálásánál az egyensúly beálltakor sőrőséggradiens keletkezik. Pl.

11 Sőrőség grádiens ultracentrifugálás Nagy sőrőségő, de kis molekulatömegő anyagok centrifugálásánál az egyensúly beálltakor sőrőséggradiens keletkezik. Pl.: CsCl Egy dalton molekulatömeg különbség már kimutatható a módszerrel (Pl.:Meselson-Stahl kísérlet) Pl.:Meselson-Stahl kísérlet Az E.coli baktériumokat 15 N táptalajon tenyésztették,majd átették ıket 14 N táptalajra. Egy generációsidı elteltével az összes DNS a hibrid sőrőséget mutatta centrifugálás során A második generációban a 14 N DNS sőrőségének megfelelı sáv is megjelenik a hibrid sáv mellett. Ez a DNS szemikonzervatív replikációjának bizonyítéka.

12 Analitikai ultracentrifuga Az ülepedési határfelületnél kialakult koncentráció-gradiens egyben törésmutatógradienst is jelent. Ezt a törésmutató-gradienst tudja az ultracentrifuga schlieren-optikája csúcs formájúra alakítani (deriválni). Ennek a csúcsnak az idıbeli elmozdulását kell filmre rögzíteni és ezeken a felvételeken mérhetık ki a szedimentációs állandó számításához szükséges adatok.

13 Az üllepedı meniszkusz többféle optikával követve: Schlieren optika Idıben mérve a front vándorlását kiszámítható a szedimentációs állandó s 1 = ω d ln dt r

14 Differenciál centrifugálás

15 Számolási példa Mekkora fordulatszámot kell beállítani a 10 cm-es rotorral rendelkezı centrifugán, g-t kell alkalmaznunk két fehérje elválasztásához? RCF = a cp RCF= 15000g a= 15000x10= a cp = ω r = 4π n r g 2 N 2 a cp = 4 π r = 0,011N r 60 N = 2 a cp 0,011r n- másodpercenkénti fordulatszám N- percenkénti fordulatszám r-sugár (m)

16 Elektroforézis Mi történik egy töltött molekulával, ha elektromos térbe kerül? + E +Ze fv ZeE - 1. Coulomb erı 2. Surlódási erı F C =ZeE E=elektromos térerő e=elemi töltés z=töltések száma Ff = f v v=sebesség f=alaki faktor (súrlódási állandó) A részecskéknek, molekuláknak elektromos erıtér hatására bekövetkezı transzlációs mozgását elektroforézisnek nevezik.

17 Erıegyensúly esetén állandó vándorlási sebesség: ZeE = fv Elektroforetikus mozgékonyság (egységnyi elektromos mozgási térre vonatkoztatott sebesség): v = l t E = U d l t idő alatt megtett út t idő U feszültségkülönbség d membrán hossz u el = ld Ut

18 Elektroforézis fajtái I. Szabad elektroforézis II. Kapilláris elektroforézis III. Gélelektroforézis 1. Agaróz géleletroforézis 2. Poliakrilamid gélelektroforézis 3. Grádiens gélelektroforézis 4. Izoelektromos fókuszálás 5. Kétdimenziós elektroforézis IV. Blotting technikák 1. Southern Blot 2. NorthernBlot 3. Western Blot

II. Kapilláris elektroforézis Elektromos térben az oldott anyagok különbözı sebességgel vándorolnak, töltésüknek és tömegüknek megfelelıen: kis méret, nagy töltés nagy mozgékonyság/gyors nagy méret,

19 II. Kapilláris elektroforézis Elektromos térben az oldott anyagok különbözı sebességgel vándorolnak, töltésüknek és tömegüknek megfelelıen: kis méret, nagy töltés nagy mozgékonyság/gyors nagy méret, kis töltés kis mozgékonyság/ lassú kapilláris detektor Az elektroforézis egy vékony µm belsı átmérıjő, pufferoldattal töltött kapillárisban történik. Detektálás: OD, λ = 200 nm puffer minta puffer elektród nagyfeszültségő tápegység elektród Dr. Gáspár Attila: Kapilláris elektroforézis

töltéső kvarc kapilláris belsı felülete (Si-O-) hidratált kationok győlnek

20 A módszer alapja Elektroozmotikus áramlás (EOF) a b c Kapilláris falán kialakuló kettısréteg Az elektroozmotikus áramlás kialakulása negatív töltéső kvarc kapilláris belsı felülete (Si-O-) hidratált kationok győlnek össze a felület közelében tömegáramlás alakul ki az elektromos tér létrehozása miatt

21 Vándorlás: 1. Kationok 2. Töltés nélküli részecskék 3. Anionok Az EOF egy másik fontos elınye, hogy az gyakorlatilag az összes részecskét, függetlenül azok töltésétıl, azonos irányú mozgásban tartja. Kapilláris Elektroforézis elınyei: Csekély hıfejlıdés Rövid mérési idı Nagy elválasztási hatékonyság Minimális mintatérfogat (1-10 nl) Könnyen automatizálható

22 III./1. Agaróz géleletroforézis Alapelv: a nukleinsavak megfelelı puffer oldatban negatív töltésőek, ezért egyenáram hatására a pozitív pólus felé vándorolnak Agaróz: -térhálós szerkezető poliszacharidláncokat tartalmaz -a kisebb méretőek gyorsabban vándorolnak ( futnak ) Gélfestés: a nukleinsavak láthatóvá tételét szolgálja Etídium-bromid: kovalensen kötıdik a nukleinsavakhoz Bekötıdve fluoreszkál UV hatására UV alatt a nukleinsavak láthatóak

23 III/2. SDS- Poliakrilamid gélelektroforézis gél pórusnagysága a monomerek koncentrációjától függ; leghatékonyabb, rutinszerően alkalmazott fehérje elválasztási módszer. Akrilamid + biszakrilamid + perszulfát poliakrilamid Összetevık: APS- elindítja a polimerizációt Temed- szabadgyök, katalizálja a polimerizációt Bisz-akrilamid-crosslinker SDS- anionos detergens A fehérje apoláros részéhez kapcsolódik Lefedi a + régiókat Minden fehérjét anionossá tesz

találhatóak, ha változik a közeg ph-ja össztöltésüket megváltoztatják. Pl.

24 III/4. Izoelektromos fókuszálás Bizonyos makromolekulák, melyekben savas és bázikus csoportok is találhatóak, ha változik a közeg ph-ja össztöltésüket megváltoztatják. Pl.: fehérjék Magas ph negatív Alacsony ph pozitív nettó töltés De egy bizonyos ph-n az össztöltés nulla izoelektromos pont Az elektroforézis ph gradiensben végezzük A fehérjék az izoelektromos pontjuknak megfelelı ph-ig vándorolnak

25 III./5. Kétdimenziós elektroforézis Csökkenı méret Csökkenı ph

26 IV. A Southern, Northern és Western Elektroforézissel a DNS, RNS vagy fehérje molekulák méret szerint elválaszthatók. A gélben elválasztott molekulák filterre blottolhatók. A filteren hibridizációval azonosíthatók a próbával homológ fragmentek, ellenanyag festéssel pedig a kérdéses fehérje. Southern-nel a gén DNS-e, Northern-nel a gén RNS-szinten történı kifejezıdése, Western-nel a fehérje kifejezıdése vizsgálható. technikák

IV./1. Southern Blot 1. A vizsgálandó DNS-t restrikciós enzimekkel emésztjük. 2.

hasonló mérető, de eltérı szekvenciájú DNS fragmentumot kapunk az emésztés során 3.

Jelölés (hibridizálás) komplementer DNS próbával festett gél autoradiogram 6.

27 IV./1. Southern Blot 1. A vizsgálandó DNS-t restrikciós enzimekkel emésztjük. 2. Gélelektroforézis során a méret szerinti elválasztás nem lesz tökéletes, mivel sok hasonló mérető, de eltérı szekvenciájú DNS fragmentumot kapunk az emésztés során 3. DNS fragmentumok denaturálása 4. Átvitel nitrocellulóz membránra 5. Jelölés (hibridizálás) komplementer DNS próbával festett gél autoradiogram 6. Az azonos hosszúságú, de eltérı szerkezető fragmentumokat a jelölés után autoradiográfiával tesszük láthatóvá.

28 IV./3. Western Blot 1. SDS-gél 2. Átblottolás nitrocellulóz membránra 3. Jelölés elsődleges monoklonális antitesttel ez specifikusan köt 4. Másodlagos antitest, ehhez színváltozással járó reakciót katalizáló enzim kapcsolódik. 5. Enzimszubsztrát hozzáadása 6. Jel detektálása

29 Köszönöm a figyelmet!

Hasonló dokumentumok

Szedimentáció, Biofizika szeminárium 2. szemeszter

Szedimentáció, Biofizika szeminárium 2. szemeszter Szedimentáció, Elektroforézis Biofizika szeminárium 2. szemeszter Makromolekulák analízise és elválasztása Szedimentáció Szedimentáció Miért van szükség centrifugálásra? A nehézségi erőtérben való ülepítés