Kapilláris elektroforézis

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Kapilláris elektroforézis"

Tibor Balog
5 évvel ezelőtt
Látták:

1 Kapilláris elektroforézis Kapilláris elektroforézis. Elméleti alapok: elektroozmózis, eof meghatározása, szabályzása elválasztási hatékonyság, zónaszélesedés 1

2 Kapilláris elektroforézis A kapilláris elektroforézis (CE) a jelenlegi legnagyobb teljesítőképességű, napjainkban is dinamikusan fejlődő elválasztástechnikai módszer. Számos előnye közé tartozik a könnyű automatizálhatóság, a minimális mintamennyiség (1-10 nl), a magas elméleti tányérszám, a rövid analízisidő, és a jól tervezhető körülmények az optimális elválasztáshoz. μ 0 i v 0 i E z i e 6πηr i elektroozmózis (elektroendozmózis): kulcsfontosságú, csak kapilláris rendszerekben fellépő jelenség

3 Áramlási profilok kvarckapillárisban CE LC Nyomás (a), illetve elektromos térerősség (b) segítségével előállított folyadékáramok áramlási profiljai. A nyilak az áramlás sebességvektorait jelölik 3

4 Áramlási profilok kvarckapillárisban 4

5 Kettős ionréteg 5

6 Diffúz réteg ε ε kt r 0 β N Ae I I 1 i z i ci r a relatív dielektromos állandó 0 a vákuum dielektromos állandója [8, F m -1 ] k a Boltzman állandó [1, J K -1 ] T a hőmérséklet [K] N A az Avogadro állandó [6, mol -1 ] e az elektron töltése [-1, C] Vizes oldatoknál 98 K hőmérsékleten és r =78,30 esetén: c i az i komponens (ion) koncentrációja [M] z i az i komponens (ion) töltésszám β 310 I 8 v EOF = μ EOF. E μ EOF az elektroozmotikus mozgékonyság μ EOF ζ ε 4πη 6

7 Diffúz ionréteg Kvarcüveg zéta-potenciáljának változása a ph függvényében kálium-nitrát vizes oldatában 7

8 EOF 8

9 EOF 9

10 Kationos detergensek az eof megváltoztatására CTAB 10

11 Kationos detergensek az eof megváltoztatására Kationos felületaktív anyagok, így a CTAB (a), és a DeTAB, DoTAB és TTAB (b) koncentrációjának hatása az elektroozmotikus mozgékonyságra. 11

12 Az eof szabályzása Változó Eredmény Megjegyzés Elektromos tér Arányos változás az Csökkentésével az elválasztás hatékonysága EOF-ben és a felbontás csökkenhet Puffer ph Ionerősség vagy pufferkoncentráció Hőmérséklet Szerves módosító adalék Felületaktív anyag Töltés nélküli, hidrofób polimerek Kovalens kötéssel kötődő anyagok Az EOF kis ph-nál csökken, nagy ph-nál nő Növekedésével csökken a zéta potenciál és az EOF A viszkozitás -3%-kal változik C-ként Megváltoztatja a zéta potenciált és a viszkozitást (általában csökken az EOF) Hidrofób és/vagy ionos kölcsönhatásokkal a kapilláris falára adszorbeálódnak Hidrofób kölcsönhatásokkal a kapilláris falára adszorbeálódnak Kémiai kötés a kapilláris falához Növelésével jelentős Joule-hő fejlődhet A legegyszerűbb és legeredményesebb módszer az EOF szabályzásához Megváltoztathatja az elválasztandó részecskék töltését vagy szerkezetét Nagy ionerősség nagyobb áramerősséget és Joule-hőt eredményez Kis ionerősség problémákat jelenthet a minta adszorpciója miatt A kapott jel alakja torzulhat, ha a vezetőképesség eltér a minta vezetőképességétől Változtatása gyakran hasznos, mivel a hőmérsékletet a készülék maga képes szabályozni Komplex változások, hatásukat legegyszerűbben kísérletesen lehet meghatározni Megváltozhat a szelektivitás Felületaktív anionok növelhetik az EOF-t Felületaktív kationok csökkenthetik az EOFt vagy megfordíthatják annak irányát Jelentősen megváltoztathatja a szelektivitást Csökkenti az EOF-t a felületi töltések elfedésével és a viszkozitás növelésével Sokféle módosítás lehetséges (hidrofób jelleg mértéke vagy töltés) A stabilitás gyakran problémákat okoz 1

aceton, benzilalkohol t K a K komponens migrációs ideje, t A az A komponens

13 Az eof meghatározása eof marker: töltésnélküli széles ph tartományban, vízoldható, ne adszorbeálódjon pl. aceton, benzilalkohol t K a K komponens migrációs ideje, t A az A komponens migrációs ideje, t EOF az EOF-t jelző anyag migrációs ideje, w K a K komponens csúcsszélessége, w A az A komponens csúcsszélessége 13

sebessége, v - az anion elektroforetikus sebessége, L eff a kapilláris

14 Az eof meghatározása v + eredő a kation eredő sebessége, v- eredő az anion eredő sebessége, v EOF az EOF sebessége, v + a kation elektroforetikus sebessége, v - az anion elektroforetikus sebessége, L eff a kapilláris effektív hossza, L t a kapilláris teljes hossza, a diffúziós kettősréteg vastagsága 14

Látszólagos (eredő) mozgékonyság μ EOF v EOF E L t eff EOF L t U effektív mozgékonyság látszólagos mozgékonyság v i v ieredő - v EOF L t eff i L t eff EOF v i az i komponens elektroforetikus

15 Látszólagos (eredő) mozgékonyság μ EOF v EOF E L t eff EOF L t U effektív mozgékonyság látszólagos mozgékonyság v i v ieredő - v EOF L t eff i L t eff EOF v i az i komponens elektroforetikus sebessége [cm s -1 ] v i(eredő) az i komponens eredő sebessége [cm s -1 ] v EOF az EOF sebessége [cm s -1 ] L eff a kapilláris effektív hossza [cm] t i az i komponens migrációs ideje [s] t EOF az EOF jelző anyagának (markerének) migrációs ideje [s] μ i v i E v i L U t L t a kapilláris teljes hossza [cm] U az alkalmazott feszültség [V] 15

/Vs] benziltrimetilammónium 3,00 0,78 0,098 3,7. 10-4 benzil-alkohol 4,6 0,180-6,8.

16 Látszólagos (eredő) mozgékonyság Benziltrimetilammónium (1), benzil-alkohol (), acetilszalicilát (3), 4-hidroxibenzoát (4) és benzoát (5) elektroferogramja Ion/vegyület t [perc] v eredő [cm/s] v [cm/s] μ [cm /Vs] benziltrimetilammónium 3,00 0,78 0,098 3, benzil-alkohol 4,6 0,180-6, acetilszalicilát 8,84 0,094-0,086-3, hidroxibenzoát 9,4 0,088-0,09-3, benzoát 10,84 0,077-0,103-3,

17 Hatékonyság, felbontás elméleti tányérszám: N 554. w t 1/ t az adott komponens migrációs ideje [s] w csúcsszélesség a csúcs félmagasságánál [s] elméleti tányérmagasság: H l eff N l eff effektív hossz [m] felbontás: R t t 1 w w 1 w csúcsszélesség a csúcs alapjánál [s] A zónaszélesedéshez hozzájáruló különböző hatások additíven összegezhetők: σ σ VO σ MO σ LD σ DE σ WA σ T σ Δμ a Gauss-görbe alakú csúcs szélességének szórásnégyzete VO: térfogati túlterhelés MO: anyagi túlterhelés LD: hosszirányú diffúzió DE: detektálás WA: adszorpció a kapilláris falára T: termikus hatások : mozgékonyságbeli különbség a puffer és a minta részecskéi között 17

18 Hosszirányú diffúzió Dt DlL ev D = az adott részecske diffúziós koefficiense N evl eel DL D A koncentrációeloszlás megváltozásának időfüggése. A t 1 <t <t 3 a Gauss-görbe standard deviációjának időfüggését, az x 1, x, x 3 az injektálási ponttól számított távolságot jelzik. 18

19 Hosszirányú diffúzió Vizes oldatokban lévő molekulák molekulatömegei és diffúziós együtthatói Anyag Molekulatömeg Diffúziós együttható [g mol -1 ] [cm s ] nátrium ion 3 1,5 etanol 46 1,08 valin 117 0,74 triptofán 04 0,61 glükóz 180 0,56 citokróm C ,11 szérum albumin (humán) ,069 fibrinogén (humán) ,019 dohánymozaik vírus ,

mutatkozó hőmérsékletgradiens a: parabola-alakú hőmérsékletcsökkenés a pufferben, b és c: exponenciális

20 Termikus hatások P U I R I U d π κ L P teljesítmény [W] d a kapilláris belső átmérője [cm] L a kapilláris hossza [cm] a puffer fajlagos vezetőképessége [S cm -1 ] A pufferben és a kapilláris falában mutatkozó hőmérsékletgradiens a: parabola-alakú hőmérsékletcsökkenés a pufferben, b és c: exponenciális hőmérsékletcsökkenés a kvarcban (kapilláris falában) és a hűtőközegben. (db: belső átmérő, dk: külső átmérő) 0

21 Termikus hatások a, Ideális eset, pusztán hosszirányú diffúzióval számolva b, A hoszirányú diffúzión kívül termikus hatásokkal is számolva 1

22 Termikus hatások szervetlen puffer (borát) szerves puffer (CAPS)

A, A mintazóna ionjainak mozgékonysága nagyobb, mint a pufferelektrolité B, A mintazóna és a

23 Elektrodiszperzió Az elektrodiszperzió okozta zónaszélesedés magyarázata: a térerősség, a minta koncentrációeloszlása és a csúcsalak megváltozása a zónában. A, A mintazóna ionjainak mozgékonysága nagyobb, mint a pufferelektrolité B, A mintazóna és a pufferelektrolit ionjainak mozgékonysága megegyezik C, A mintazóna ionjainak mozgékonysága kisebb, mint a pufferelektrolité 3

24 Fali adszorpció Diaminopropán adalék koncentrációjának hatása a faladszorpció miatt kialakuló zónaszélesedésre 4

25 Túlterhelés 5

26 Zónaszélesedés (összefoglalás) A zónaszélesedés oka Hosszirányú diffúzió Megjegyzés A meghatározás időtartamával és a diffúziós együtthatóval egyenes arányban, a molekulatömeggel fordított arányban nő. Termikus hatások Hőáramláshoz és a puffer viszkozitásának helyi megváltozásához vezet. Injektálás hossza A mintakomponensek adszorpciója a falhoz Elektrodiszperzió (mozgékonyságbeli különbségek) Magasságkülönbség a folyadékok szintjében Kisebbnek kell lennie a diffúzió által létrehozott zónánál; az injektálás hosszúságának növelésével a kimutatási határ javítható. Lassan süllyedő csúcsalakokat (tailing) okoz, a migrációs idők reprodukálhatósága romlik. Háromszög-alakú csúcsokat okoz. Lamináris áramlás parabolaszerű áramlási profillal. 6

Hasonló dokumentumok

ELMÉLETI, SZÁMOLÁSI FELADATOK

ELMÉLETI, SZÁMOLÁSI FELADATOK 1. B vitamin komplex (keverék) meghatározása CZE és MEKC módszerrel A módszer leírása: A vízoldható B1 (tiamin hidroklorid), B2 (riboflavin), B3 (niacinamid) és B6 (piridoxin