KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS (2)

Átírás

1 Kapilláris elektroforézis Ph.Hg.VIII. Ph.Eur KAPILLÁRIS ELEKTROFORÉZIS (2) 01/2010:20247 ÁLTALÁNOS ALAPELVEK A kapilláris elektroforézis fizikai vizsgálómódszer, amely elektrolit oldatban oldott töltött részecskék egyenáramú elektromos erőtér hatására bekövetkező, kapillárison belüli vándorlásán alapul. A vizsgált anyag vándorlási sebességét E erősségű elektromos erőtérben az anyag elektroforetikus mozgékonysága (mobilitása) és a tompítóoldat kapillárison belüli elektroozmotikus mozgékonysága szabja meg. Az oldott anyag elektroforetikus mozgékonysága (µ ep ) az oldott anyag tulajdonságaitól (elektromos töltés, molekulaméret és alak) és a vándorlás közegéül szolgáló tompítóoldat tulajdonságaitól (az elektrolit típusa, az ionerősség, a ph, a viszkozitás és az adalékanyagok) függ. Az oldott anyag elektroforetikus sebessége (v ep ) feltéve, hogy gömb alakú, az alábbi egyenlettel írható le: v ep q V = μ ep E = 6πηr L q = az oldott anyag effektív töltése, η = az elektrolitoldat viszkozitása, r = az oldott anyag Stokes sugara, V = az alkalmazott feszültség, L = a kapilláris teljes hossza. Ha egy tompítóoldattal töltött kapillárisban elektromos erőteret hozunk létre, a kapilláris belsejében az oldószer áramlásba jön, melyet elektroozmotikus áramlásnak nevezünk. Az elektroozmotikus áramlás sebessége függ az elektroozmotikus mozgékonyságtól (µ eo ), mely a kapilláris belső falának töltéssűrűségétől és a tompítóoldat tulajdonságaitól függ. Az elektroozmotikus sebesség (v eo ) az alábbi egyenlettel írható le: v eo = μ eo εζ V E = η L ε = a tompítóoldat dielektromos állandója, ζ = a kapilláris felületének zéta potenciálja. Az oldott anyag sebessége az alábbi egyenlet szerint számítható: ν = ν ep + ν eo (2) ) Ez a fejezet gyógyszerkönyvi harmonizációs eljáráson esett át. Lásd 5.8 Gyógyszerkönyvi harmonizáció (9.14) c. fejezetet.

2 Kapilláris elektroforézis Ph.Hg.VIII. Ph.Eur A meghatározandó anyag elektroforetikus mozgékonysága és az elektroozmotikus mozgékonyság az oldott anyag töltésétől függően azonos és ellentétes irányú is lehet. A normál kapilláris elektroforézis során az anionok szembe vándorolnak az elektroozmotikus áramlással és a sebességük kisebb lesz, mint az elektroozmotikus sebesség. A kationok azonos irányba vándorolnak az elektroozmotikus áramlással és a sebességük nagyobb lesz, mint az elektroozmotikus sebesség. Olyan körülmények közt, mikor az elektroozmotikus sebesség nagy az oldott anyagok elektroforetikus sebességéhez képest, a kationok és anionok egyidejűleg is elválaszthatók. Azt az időt (t), mely ahhoz szükséges, hogy az oldott anyag a kapillárisban az injektálás helyétől a detektálás helyéig (l, a kapilláris effektív hossza) vándoroljon, az alábbi egyenlettel adhatjuk meg: l l L t = = ν + ν (μ + μ ) V ep eo ep eo Általában az ionizált szilanol csoportok következtében az ömlesztett kvarc kapilláris belső fala ph=3 felett negatív töltésű. Ebből következik, hogy az elektroozmotikus áramlás az anódtól a katód irányába történik. Az oldott anyag vándorlási sebességének jó reprodukálhatóságához az elektroozmotikus áramlásnak analízisről analízisre állandónak kell lennie. Néhány alkalmazáshoz szükség lehet az elektroozmotikus áramlás csökkentésére vagy visszaszorítására. Ehhez vagy a kapilláris belső falát módosítják, vagy a tompítóoldat koncentrációját, összetételét és/vagy ph-ját változtatják meg. A minta kapillárisba juttatása után, a minta minden ionja a háttér elektrolitban, elektroforetikus mozgékonyságának megfelelően, különálló zónákban vándorol. A zónaszélesedés, azaz az oldott anyagok sávjainak kiszélesedése, több különböző tényező eredménye. Ideális körülmények között az oldott anyag zónaszélesedésének egyetlen oka az oldott anyag molekuláinak hosszirányú diffúziója a kapillárisban (longitudinális diffúzió). Ebben az ideális esetben a zóna hatékonyága az elméleti tányérszámmal (N) kifejezve a következő: (μ N = ep + μeo ) V l 2 D L D = az oldott anyag molekuláris diffúziós koefficiense a tompítóoldatban. A gyakorlatban egyéb tényezők is, mint például a hőleadás, a minta adszorpciója a kapilláris falán, a minta és a tompítóoldat eltérő vezetőképessége, az injektált mintadugó hossza, a detektorcella mérete és a tompítóoldatok folyadékszintjének eltérése szignifikánsan hozzájárulhatnak a zónaszélesedéshez. Két sáv elválása, melyet a felbontással (R s ) fejezhetünk ki, elérhető a vizsgált anyagok elektroforetikus mozgékonyságának vagy a kapillárisban létrejövő elektroozmotikus mozgékonyságnak a módosításával, illetve az anyagokhoz tartozó sávok hatékonyságának növelésével az alábbi összefüggés szerint: R s = N 4 ( μ epb μepa ) ( μ μ ) ep eo

3 Kapilláris elektroforézis Ph.Hg.VIII. Ph.Eur µ epa és µ epb = a két elválasztandó anyag elektroforetikus mozgékonysága, μ ep = a két anyag elektroforetikus mozgékonyságainak átlaga ( μep = ½ (µ epb + µ epa )). KÉSZÜLÉK A kapilláris elektroforézis készülék részei: nagyfeszültséget biztosító, szabályozható egyenfeszültséget adó áramforrás, két tompítóoldat tartály, mely az előírt anódos és katódos oldatokat azonos folyadékszinten tartalmazza, két elektród (a katód és az anód), mely a megfelelő tompítóoldat tartályába merül és az áramforráshoz kapcsolódik, elválasztó kapilláris (általában kvarckapilláris); bizonyos detektortípusok alkalmazása esetén, a kapillárison egy, a detektornak megfelelően kialakított optikai ablakkal. A kapilláris végei a tompítóoldatok tartályaiba merülnek. A kapillárist a cikkelyben előírt oldattal töltjük meg, alkalmas injektáló rendszer, detektor, mely képes kimutatni a vizsgált anyagoknak az elválasztókapilláris egy szegmensén adott időben áthaladó mennyiségeit. A detektálás rendszerint abszorpciós spektrofotometrián (UV vagy látható fény) vagy fluorimetrián alapul, de speciális esetekben a vezetőképességi, amperometriás vagy tömegspektrometriás detektálás is hasznos lehet. A nem UV-abszorbeáló vagy nem fluoreszcens tulajdonságú anyagok meghatározásának másik lehetséges módja az indirekt detektálás, ahhoz, hogy az elválasztás jól reprodukálható legyen, ajánlatos egy, a kapillárison belül állandó hőmérsékletet biztosító, termosztátot használni, regisztráló és alkalmas integrátor vagy számítógép. A pontos, kvantitatív analízishez nélkülözhetetlen az injektálási eljárás pontos leírása és automatizálása. Az injektálás történhet gravitációs módszerrel, nyomás vagy vákuum alkalmazásával, és használhatunk elektrokinetikus injektálást is. Elektrokinetikus injektálás esetén a mintakomponensek bevitt mennyisége az adott komponens elektroforetikus mozgékonyságától függ, így ennél az injektálási módnál fennáll a diszkrimináció lehetősége. A szóbanforgó gyógyszeranyag cikkelyében előírt kapillárist, tompítóoldatokat, előkondícionáló módszert, mintaoldatot és vándorlási körülményeket alkalmazzuk. A használandó elektrolitoldatokat a részecskék eltávolítása érdekében megszűrjük, és mivel a buborékképződés zavarhatja a detektálási rendszert, és megszakíthatja az elektromos kapcsolatot a kapillárisban az elválasztási folyamat közben, gázmentesítjük. Az oldott anyagok reprodukálható vándorlási ideje érdekében minden egyes analitikai módszer esetén szigorú öblítő eljárást kell kidolgozni. KAPILLÁRIS ZÓNAELEKTROFORÉZIS ALAPELV A kapilláris zónaelektroforézis esetében a meghatározandó anyagok egy olyan kapillárisban válnak szét, mely csak tompítóoldatot tartalmaz, így olyan közeg, mely az áramlást

4 Kapilláris elektroforézis Ph.Hg.VIII. Ph.Eur akadályozná, nincs benne. E technikánál az elválasztás azért jön létre, mert a minta különböző komponensei diszkrét sávokban, eltérő sebességgel vándorolnak. Mindegyik sáv sebessége az oldott anyag elektroforetikus mozgékonyságától és a kapillárison belüli elektroozmotikus áramlástól függ (lásd Általános alapelvek). A kvarckapilláris felületén adszorbeálódó anyagok elválaszthatóságának javítása érdekében bevont kapillárisok is alkalmazhatók. A kapilláris elektroforézis ezen módszerével mind a kis (M r < 2000), mind a nagy (2000 < M r < ) molekulatömegű anyagok analízise megoldható. A szabadoldatos kapilláris elektroforézis esetében elérhető nagy hatékonyság miatt, e módszerrel olyan molekulák elválasztása is lehetséges, melyek töltés/tömeg aránya csak nagyon kicsit különbözik. Az elválasztó tompítóoldatba királis vegyületet (szelektort) téve, királis vegyületek elválasztása is megvalósítható. OPTIMALIZÁLÁS Az elválasztás optimalizálása összetett folyamat, néhány elválasztási paraméternek nagy szerepe lehet. Az elválasztási módszerek kidolgozásánál figyelembe veendő fő tényezők a készülék és az elektrolit-oldat paraméterei. A készülék paraméterei Feszültség. A Joule hő függvény jól használható az alkalmazott feszültség és a kapilláris hőmérséklet optimalizálása során. Az elválasztás ideje az alkalmazott feszültséggel fordítottan arányos. A feszültség növelése azonban túlzott mértékű hőtermelődéshez, emiatt hőmérsékletemelkedéshez, és ennek eredményeképpen a kapillárison belül a tompítóoldatban viszkozitásgradiens kialakulásához vezethet. Ez a hatás zónaszélesedést és így felbontáscsökkenést okozhat. Polaritás. Az elektród polaritás lehet normál (anód a bemenetnél, katód a kimenetnél) és az elektroozmotikus áramlás a katód irányába történik. Ha az elektródok polaritása felcserélődik, akkor az elektroozmotikus áramlás kimenettől a bemenet irányába mutat, és csak azok a töltéssel rendelkező részecskék jutnak el a kimenethez, melyeknek az elektroforetikus mozgékonysága nagyobb az elektroozmotikus áramlásnál. Hőmérséklet. A hőmérséklet legnagyobb hatással a tompítóoldat viszkozitására és az elektromos vezetőképességre, és emiatt a vándorlási sebességre van. Néhány esetben a kapilláris hőmérsékletének emelkedése a fehérjék konformációs változását és emiatt vándorlási idejük és elválasztásuk hatékonyságának változását idézheti elő. Kapilláris. A kapilláris mérete (hossz és belső átmérő) befolyásolja az analízis idejét, az elválás hatékonyságát és az injektálható anyag mennyiségét. Az effektív hossz és a teljes hossz növelésével az elektromos tér erőssége csökkenhet (állandó feszültség alkalmazása esetén), ami megnöveli a vándorlás idejét. Adott tompítóoldat és elektromos térerősség esetén a hőleadás és emiatt a sávszélesedés a kapilláris belső átmérőjétől függ. Ez utóbbi hatással van a kimutatási határra is, az injektált minta térfogatától és az alkalmazott detektálási módtól függően. Mivel a minta komponenseinek a kapilláris falán történő adszorpciója korlátozza a hatékonyságot, az elválasztási módszerek kidolgozásánál megfontolandó az e kölcsönhatást kiküszöbölő technikák alkalmazása. A fehérjék speciális esetében a kapilláris falán történő adszorpció elkerülésére már sokféle stratégiát kidolgoztak. E módszerek némelyikénél (extrém ph alkalmazása és pozitív töltésű tompítóoldat adalékanyagok adszorpciója) a fehérjék adszorpciójának megelőzésére csak a tompítóoldat összetételét kell módosítanunk. Más módszereknél a kapilláris belső falát a kvarcfelülethez kovalensen kötött polimerrel vonják be, mely megakadályozza, hogy a fehérje és a kvarckapilláris felületének negatív töltése között kölcsönhatás jöhessen létre. Erre a célra semleges-hidrofil, kationos és anionos polimerekkel borított, előregyártott kapillárisok kaphatók.

5 Kapilláris elektroforézis Ph.Hg.VIII. Ph.Eur Az elektrolit-oldat paraméterei A tompítóoldat típusa és koncentrációja. A kapilláris elektroforézis céljára az olyan tompítóoldatok alkalmasak, melyek pufferkapacitása a választott ph-tartományban megfelelő és ionjainak mozgékonysága kicsi, emiatt minimális a létrehozott áramerősség nagysága. A sávtorzulás minimalizálása érdekében fontos, hogy ha lehetséges, a tompítóoldat ionjainak és az oldott anyag ionjainak mozgékonysága hasonló legyen. A minta készítéséhez használt oldószer típusa is fontos, hogy a kolonnán (on-column) mintadúsulást érjünk el, mely növeli az elválás hatékonyságát és javítja a detektálást. Adott ph esetén a tompítóoldat koncentrációjának növelése csökkenti az elektroozmotikus áramlást és az oldott anyag sebességét. A tompítóoldat ph-ja. A tompítóoldat ph-ja a meghatározandó anyag és az adalékanyagok töltésének módosításán és az elektroozmotikus áramlás változtatásán keresztül hat az elválasztásra. Fehérjék és peptidek elválasztásakor a tompítóoldat ph-jának az izoelektromos pont (pi) fölötti értékről az izoelektromos pont alatti értékre csökkentése az oldott anyag eredő töltésének negatívból pozitívvá válását eredményezi. A tompítóoldat ph-jának növelése általában növeli az elektroozmotikus áramlást. Szerves oldószerek. A vizsgált anyag vagy más adalékanyagok oldhatóságának növelésére, illetve a minta komponensei ionizáltsági fokának befolyásolására a vizes tompítóoldathoz szerves módosítók (metanol, acetonitril, stb.) adhatók. Ha a tompítóoldathoz ilyen szerves módosítókat adunk, általában lecsökken az elektroozmotikus áramlás. Királis elválasztások adalékanyagai. Az optikai izomerek elválasztásához királis szelektort adunk az elválasztó tompítóoldathoz. A leggyakrabban alkalmazott királis szelektorok a ciklodextrinek, de koronaétereket, poliszacharidokat és fehérjéket is alkalmazunk. A királis komponensekre elérhető felbontás nagymértékben függ az alkalmazott királis szelektor típusától, mivel a királis felismerést a királis szelektor és az egyes enantiomerek közötti kölcsönhatás különbözősége szabályozza. E szempontból egy adott elválasztás kidolgozásánál hasznos, ha különböző üregméretű (gyűrűnagyságú) (α-, β- és γ-ciklodextrin) illetve semleges (metil, etil, hidroxialkil stb.) vagy ionizálható (aminometil, karboximetil, szulfobutil éter stb.) csoportokkal módosított ciklodextrineket is kipróbálunk. Módosított ciklodextrineknél figyelembe kell venni a ciklodextrinek szubsztituáltsági fokának gyártási tételről-tételre való különbözőségét, mivel ez a szelektivitást is befolyásolja. Királis elválasztás esetén az elválasztásra ható további tényezők: a királis szelektor koncentrációja, a tompítóoldat összetétele, ph-ja és a hőmérséklet. A szerves adalékanyagok, mint például a metanol vagy a karbamid, alkalmazása szintén módosíthatja az elérhető felbontást. KAPILLÁRIS GÉLELEKTROFORÉZIS ALAPELV A kapilláris gélelektroforézis esetében az elválasztás egy molekulaszűrőként viselkedő géllel töltött kapillárisban játszódik le. Azon molekulák melyeknek töltés/tömeg hányadosuk megegyezik elválaszthatók molekula méretük szerint, mivel a kisebb molekulák könnyebben jutnak át a gél hálón, és gyorsabban vándorolnak, mint a nagyobbak. Különböző biológiai makromolekulák (például fehérjék és DNS-szakaszok), melyeknek gyakran egyforma a töltés/tömeg hányadosuk, a molekulatömegük szerint így gélelektroforézissel elválaszthatók. A GÉLEK TULAJDONSÁGAI A kapilláris gélelektroforézisben kétféle géltípust használnak: folyamatosan borított géleket és dinamikusan borított géleket. A folyamatosan borított géleket, mint például a térhálós

6 Kapilláris elektroforézis Ph.Hg.VIII. Ph.Eur poliakrilamidot a kapillárison belül a monomerekből történő polimerizációval állítják elő. Rendszerint a kapilláris kvarcfalához kötöttek és így a kapilláris roncsolása nélkül nem távolíthatók el belőle. Ha a gélt fehérjeanalízisre használják redukáló körülmények között, az elválasztó tompítóoldat rendszerint nátrium-dodecil-szulfátot is tartalmaz, és a mintát az injektálás előtt nátrium-dodecil-szulfát és 2-merkaptoetanol vagy ditiotreitol elegyében hővel denaturálják. Nem használnak 2-merkaptoetanolt és ditiotreitolt nem redukáló körülmények között (például ép antitest analízisnél). A térhálós gélekben az elválasztás az elválasztó tompítóoldat változtatásával (a kapilláris zónaelektroforézis részben leírtak szerint) és a gél porozitásának szabályozásával (a gél készítése során) optimalizálható. A térhálós poliakrilamid gélek porozitását az akrilamid koncentrációjának és/vagy a keresztkötő komponens arányának módosításával lehet megváltoztatni. Szabályként elmondható, hogy a gél porozitásának csökkentése az oldott anyag mozgékonyságának csökkenéséhez vezet. Az ilyen típusú gélek törékenysége miatt csak elektrokinetikus injektálás alkalmazható. A dinamikusan borított gélek hidrofil polimerek, mint például a lineáris poliakrilamid, a cellulóz-származékok, a dextrán stb., melyek a vizes elválasztó tompítóoldatokban feloldhatók, és a feloldás eredményeképpen az elválasztó tompítóoldat molekulaszűrőként is viselkedik. Ezek az elválasztó közegek könnyebben előállíthatók, mint a térhálós polimerek. Elkészíthetők egy üvegcsében és nyomás segítségével a bevont falú kapillárisba (elektroozmotikus áramlás kiküszöbölése) tölthetők. A gél minden injektálás előtti cseréje általában javítja az elválasztás reprodukálhatóságát. A gél porozitása növelhető nagy molekulatömegű polimerek alkalmazásával (adott polimerkoncentráció esetén) vagy a polimerkoncentráció csökkentésével (adott molekulatömeg esetén). A gél porozitásának csökkentése ugyanazon tompítóoldat esetén az oldott anyag mozgékonyságának csökkenéséhez vezet. Mivel e polimerek oldásával a tompítóoldat viszkozitása alacsony marad, hidrodinamikus és elektrokinetikus injektálási technika egyaránt alkalmazható. KAPILLÁRIS IZOELEKTROMOS FÓKUSZÁLÁS ALAPVELV Az izoelektromos fókuszálás esetében a molekulák elektromos erőtér hatására ph-gradiensben vándorolnak mindaddig, míg töltéssel rendelkeznek. A ph-gradiens az elválasztó tompítóoldatban széles pi tartományú amfolitok (poli-aminokarbonsavak) oldásával alakítható ki. Az izoelektromos fókuszálásnak három alaplépése van, a töltés, a fókuszálás és a mobilizálás. Töltés. Két módszer alkalmazható: töltés egy lépésben: a mintát összekeverjük az amfolitokkal, és a keveréket a kapillárisba nyomás vagy vákuum segítségével juttatjuk be; szakaszos töltés: a kapillárisba először az indító tompítóoldatot, majd az amfolitokat, majd az amfolitokkal kevert mintát, megint csak amfolitokat, és végül a záró tompítóoldatot töltjük be. A minta térfogatának megfelelően kicsinek kell lennie ahhoz, hogy ne módosuljon a ph-gradiens. Fókuszálás. A feszültség rákapcsolásakor az amfolitok össztöltésük eredőjének megfelelően a katód vagy az anód felé vándorolnak, és így egy ph-gradienst alakítanak ki az anódtól (alacsonyabb ph) a katód felé (magasabb ph). Közben az elválasztandó komponensek addig vándorolnak, míg elérik az izoelektromos pontjuknak (pi) megfelelő ph-t és az áram nagyon kis értékre esik le.

7 Kapilláris elektroforézis Ph.Hg.VIII. Ph.Eur Mobilizálás. Ha mobilizálás szükséges a detektáláshoz, a következő módszerek közül választhatunk. az első módszernél a mobilizálás a fókuszálás közben valósul meg az elektroozmotikus áramlás hatására; az elektroozmotikus áramlásnak megfelelően kicsinek kell lennie ahhoz, hogy lehetővé tegye a komponensek fókuszálódását; a második módszernél a mobilizálás a fókuszálás után alkalmazott (pozitív) nyomás révén valósul meg; a harmadik módszernél a mobilizálást úgy valósítják meg, hogy a fókuszálás után a katód vagy az anód tartályába (ez a mobilizálás irányának megválasztásától függ) sót adagolnak azért, hogy a feszültség rákapcsolásakor a kapillárisban a ph megváltozzék. Amint a ph megváltozott, a fehérjék és az amfolitok afelé a tartály felé vándorolnak, amelybe a sót adagoltuk, és így elhaladnak a detektor előtt. Az elért elválasztás, amelyet a ΔpI-vel fejezhetünk ki, függ a ph-gradienstől ( d ph dx), a különböző pi értékekkel rendelkező amfolitok számától, a molekula diffúziós koefficiensétől (D), az elektromos térerőtől (E) és a vizsgált anyag elektroforetikus mobilitásának a ph-tól való dμ dph : függésétől ( ) ΔpI = 3 D dph dx E dμ dph OPTIMALIZÁLÁS Az elválasztás kidolgozásánál az alábbi fő paramétereket kell figyelembe venni: Feszültség. A kapilláris izoelektromos fókuszálás igen erős elektromos teret alkalmaz ( V/cm) a fókuszálási lépésben. Kapilláris. A mobilizálás módszerétől függően (lásd fentebb) az elektroozmotikus áramlást csökkenteni kell. A bevont falú kapillárisok feladata az elektroozmotikus áramlás csökkentése. Oldatok. Az anód tompítóoldat-tartályába a legsavasabb karakterű amfolit pi értékénél alacsonyabb, a katód tartályába a legbázikusabb karakterű amfolit pi értékénél magasabb ph-jú tompítóoldatot kell tölteni. Az anód oldalán foszforsavat, a katódos oldalon nátrium-hidroxidot alkalmaznak a leggyakrabban. Az amfolit oldatba adagolt polimer, mint például a metilcellulóz, feladata a konvekciós hatások visszaszorítása (ha vannak) és az elektroozmotikus áramlás csökkentése a viszkozitás növelése révén. A kereskedelemből sokféle ph-tartományú amfolit is beszerezhető, de szükség esetén összekeverésükkel szélesebb ph-tartomány is előállítható. Széles ph-tartományt az izoelektromos pont becslésére alkalmazunk, a szűkebb ph-tartományokkal a pontosság javítható. Jelzőfehérjék sorozatával a vándorlási idők és az izoelektromos pontok között kalibrációs görbe szerkeszthető. Szükség esetén a fókuszálás során a fehérjék izoelektromos pontján bekövetkező kicsapódás megelőzhető olyan tompítóoldat adalékanyagok alkalmazásával, mint a glicerin, felületaktív anyagok, karbamid, vagy ikerionos tompítóoldatok. A karbamid ugyanakkor a koncentrációjától függően denaturálhatja is a fehérjéket. MICELLÁRIS ELEKTROKINETIKUS KROMATOGRÁFIA (MEKC)

8 Kapilláris elektroforézis Ph.Hg.VIII. Ph.Eur ALAPELV A micelláris elektrokinetikus kromatográfiában az elválasztás olyan elektrolit oldatban jön létre, mely a felületaktív anyagot a kritikus micelláris koncentrációnál (cmc) nagyobb töménységben tartalmazza. Az oldott anyagok, megoszlási koefficiensük szerint, megoszlanak a vizes tompítóoldat és a micellák, mint pszeudo állófázisok között. Emiatt ez a technika az elektroforézis és a kromatográfia kombinációjának fogható fel. E módszerrel a készülék módosítása nélkül mind semleges, mind töltéssel rendelkező anyagok is elválaszthatók, megőrizve a kapilláris elektroforézis hatékonyságát, sebességét. A MEKC-ben leggyakrabban alkalmazott felületaktív anyagok egyike a nátrium-dodecil-szulfát, mely anionos felületaktív anyag, de ezen kívül más felületaktív anyagokat, például kationos felületaktív tulajdonságú cetil-trimetil-ammónium sókat is alkalmaznak. Az elválasztás mechanizmusa a következő: Semleges és lúgos ph-n erős elektroozmotikus áramlás keletkezik, mely az elválasztó tompítóoldat ionjait a katód irányába mozgatja. Ha felületaktív anyagként nátrium-dodecil-szulfátot alkalmazunk, az anionos micellák elektroforetikus vándorlása ellenkező, anódirányú. Ennek eredményeképp a micella vándorlási sebessége lelassul az elektrolitoldat áramlási sebességéhez képest. Semleges oldott anyagok esetében, mivel a meghatározandó anyag megoszlik a micella és a vizes tompítóoldat között, és nincs elektroforetikus mozgékonysága, a meghatározandó anyag vándorlási sebessége csak a micella és a vizes tompítóoldat közti megoszlási koefficiensétől fog függni. Az elektroferogramon a töltéssel nem rendelkező anyagok csúcsai mindig az elektroozmotikus áramlást jelző vegyület és a micella csúcsai között helyezkednek el (e két csúcs között eltelt időt nevezik elválasztási ablaknak). Az elektromosan töltött oldott anyagok esetében a vándorlási sebesség mind az oldott anyag micella és vizes tompítóoldat közti megoszlási koefficiensétől mind a micellák távollétében mérhető elektroforetikus mozgékonyságától függ. Mivel a semleges és a gyengén ionizált oldott anyagok mechanizmusa a MEKC-ben alapvetően kromatográfiás jellegű, az oldott anyagok vándorlása és a felbontás az oldott anyag retenciós faktorával (k), más néven a tömegmegoszlási arányával (D m ) írható le, a mely a micellákban és a mozgó fázisban lévő oldott anyagok mólszámainak hányadosa. Semleges komponens esetén k az alábbi képlet szerint számítható: k = t 0 t R t0 t 1 t R mc V = K V S M t R = az oldott anyag vándorlási ideje, t 0 =a nem visszatartott oldott anyag analízisideje (meghatározásához elektroozmotikus áramlást jelző anyagot (például metanolt) injektálunk, mely a micellákba nem lép be), t mc =a micella vándorlási ideje ( meghatározásához micella jelző anyagot, például Szudán III-at injektálunk, mely vándorlása közben folyamatosan a micellában van), K = az oldott anyag megoszlási koefficiense, V S = a micellafázis térfogata, V M = a mozgófázis térfogata. Hasonlóképpen, két, egymáshoz közel vándorló oldott anyag közti felbontás (R S ) megadható az alábbiak szerint

9 Kapilláris elektroforézis Ph.Hg.VIII. Ph.Eur R S = N 4 t0 1 α 1 k t b mc α kb + 1 t0 1+ k a tmc N = az egyik anyagra kapott elméleti tányérszám; α = szelektivitás; k a és k b = a két anyag retenciós faktora (k b >k a ); A fentiekhez hasonló, de nem azonos egyenletek írják le az elektromosan töltött anyagok k és R S értékeinek számítását. OPTIMALIZÁLÁS A MEKC-et alkalmazó elválasztások tervezésénél a készülék és az elektrolitoldat paraméterei a legfontosabb figyelembe veendő tényezők. A készülék paraméterei Feszültség. Az elválasztási idő fordítottan arányos az alkalmazott feszültséggel. Bár a feszültség emelése túlzott hőtermelődést okozhat, mely a kapilláris keresztmetszetében hőmérséklet- és viszkozitásgradienst idéz elő a tompítóoldatban. Ez a hatás nagy vezetőképességű tompítóoldatoknál, mint amilyenek a micellákat tartalmazók is, szignifikáns lehet. A rossz hőelvezetés sávszélesedéshez és felbontáscsökkenéshez vezet. Hőmérséklet. A kapilláris hőmérsékletének változása befolyásolja az oldott anyag tompítóoldat és micella közötti megoszlási hányadosát, a kritikus micelláris koncentrációt, és a tompítóoldat viszkozitását. Ezen paraméterek mindegyike hatással van az oldott anyag vándorlási idejére. Jó hűtőrendszer alkalmazása javítja az oldott anyagok vándorlási idejének a reprodukálhatóságát. Kapilláris. Mint ahogy a szabadoldatos kapilláris elektroforézis esetében is, a kapilláris dimenziója (hossz és belső átmérő) befolyásolja az analízis idejét és az elválasztás hatékonyságát. A kapilláris effektív és teljes hosszának növelése csökkenti az elektromos erőteret (azonos feszültségen dolgozva), növeli a vándorlási időt és javítja az elválasztás hatékonyságát. A belső átmérő hatással van a hőleadásra (adott tompítóoldat és elektromos erőtér esetén) és ebből következően a mintasáv kiszélesedésére. Az elektrolit-oldat paraméterei A felületaktív anyag típusa és koncentrációja. A felületaktív anyag típusa a kromatográfiás állófázishoz hasonlóan, hatással van a felbontásra, mivel módosítja az elválasztás szelektivitását. A semleges komponens log k értéke is egyenesen arányosan nő a mozgófázis felületaktív anyag koncentrációjával. Mivel a felbontás a MEKC-ben maximumot ér el amikor k megközelíti a t mc t 0 értéket, a felületaktív anyag koncentrációjának változtatása a mozgó fázisban megváltoztatja a kapott felbontást. A tompítóoldat ph-ja. Bár a ph nem módosítja a nemionos komponensek megoszlási koefficiensét, megváltoztathatja az elektroozmotikus áramlást a nembevont falú kapillárisban. A

10 Kapilláris elektroforézis Ph.Hg.VIII. Ph.Eur tompítóoldat ph-jának csökkenése csökkenti az elektroozmotikus áramlást, és emiatt növeli a semleges anyagok felbontását a MEKC-ben, és egyúttal hosszabb analízis időt is eredményez. Szerves oldószerek. A hidrofób komponensek MEKC elválasztásának javítására szerves módosítók (metanol, propanol, acetonitril, stb.) adhatók az elektrolit oldathoz. E módosítók hozzáadása rendszerint csökkenti a vándorlási időt és az elválasztás szelektivitását. Mivel a szerves módosítók hozzáadása hatással van a kritikus micelláris koncentrációra, egy adott felületaktív anyag koncentráció csak egy bizonyos szerves módosító százalék tartományon belül használható. E tartományon kívül a szerves módosító gátolja vagy kedvezőtlenül befolyásolja micellaképzést, így micellák nem jönnek létre és emiatt megoszlás sincs. A szerves oldószerek nagy koncentrációi esetében a micellák disszociációja nem minden esetben jelenti azt, hogy az elválasztás tovább már nem lehetséges; néhány esetben a hidrofób kölcsönhatás az ionos felületaktív anyag monomerje és a semleges oldott anyag között szolvofób komplexet képez, mely elektroforetikusan elválasztható. Királis elválasztás adalékanyagai. A MEKC-cel történő enantiomer elválasztás esetén a micellarendszer királis szelektort tartalmaz, amelyet vagy kovalensen kötnek a felületaktív vegyülethez, vagy a micelláris elválasztó elektrolithoz adunk. A királis megkülönböztetésre képes részt tartalmazó micellák közé tartoznak az N-dodekanoil-L-aminosavak sói, az epesók stb. A királis elválasztás királis diszkriminátorok alkalmazásával is elérhető - ilyenek például a ciklodextrinek - melyeket az akirális, micella állapotú felületaktív anyagokat tartalmazó elektrolit oldathoz adunk. Egyéb adalékanyagok. A tompítóoldathoz adagolt vegyszerekkel a szelektivitás sokféleképpen módosítható. A tompítóoldathoz különböző típusú ciklodextrineket adva, a hidrofób oldott anyag és a micella közti kölcsönhatás csökkenthető, mely e típusú komponensek esetében a szelektivitás növekedését eredményezi. A MEKC-cel végzett elválasztások szelektivitásának javítására olyan anyagokat (is) használnak, melyek a micellán adszorbeálódva képesek az oldott anyag-micella közti kölcsönhatást módosítani. Ezek az adalékok lehetnek szintén felületaktív anyagok (ionos vagy nem-ionos), melyek kevert micellák képződését idézik elő, vagy fémkationok, melyek a micellában oldódva koordinációs komplexeket képeznek az oldott anyaggal. MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁS A csúcsterületeket a megfelelő vándorlási idővel elosztva kapjuk meg a korrigált területeket. A korrigált területek alkalmazásával: kompenzáljuk a vándorlási idő mérésről mérésre történő elcsúszását, így csökkentjük a válasz variációját (szórását), kompenzáljuk a minta összetevőinek eltérő vándorlási idejéből fakadó válaszkülönbségeket. Amennyiben belső standardot használunk, bizonyítani kell, hogy a csúcsa nem fedi el a vizsgálandó anyag egyetlen csúcsát sem. SZÁMÍTÁSOK A kapott adatokból kiszámítjuk a vizsgált komponens(ek) mennyiségét a vizsgálandó anyagban. Ha a cikkely normalizációs eljárást ír elő, a vizsgálandó anyag egy vagy több komponensének százalékos mennyiségét úgy határozzuk meg, hogy a csúcs(ok) korrigált területét az összes csúcs korrigált területe összegének százalékában fejezzük ki; az oldószernek és a hozzáadott reagenseknek megfelelő csúcsokat nem vesszük figyelembe. Automatikus integráló rendszer (integrátor vagy adatgyűjtő és feldolgozó rendszer) alkalmazása javasolt. RENDSZERALKALMASSÁG

11 Kapilláris elektroforézis Ph.Hg.VIII. Ph.Eur A kapilláris elektroforézises rendszer viselkedésének ellenőrzésére a rendszeralkalmassági jellemzőket használjuk. E paraméterek megválasztása függ az alkalmazott kapilláris elektroforézises módszertől. E rendszeralkalmassági paraméterek: a kapacitásfaktor (k) (csak a micelláris elektrokinetikus kromatográfiánál), az elméleti tányérszám (N), a szimmetriafaktor (A s ) és a felbontás (R s ). N és R s elméleti kifejezéseit az előző részekben írtuk le, de azokat a sokkal gyakorlatiasabb egyenleteket, melyek lehetővé teszik e paraméterek elektroferogramról való kiszámítását, az alábbiakban adjuk meg. LÁTSZÓLAGOS ELMÉLETI TÁNYÉRSZÁM A látszólagos elméleti tányérszám (N) az alábbi képlet alapján számolható: t 5,54 R N =, wh t R =vándorlási idő vagy távolság, melyet az alapvonalon, az injektálási pont és a komponens csúcsmaximumából az alapvonalra bocsátott merőleges között mérünk, w h = a csúcsmagasság felénél mért csúcsszélesség (félértékszélesség). FELBONTÁS Két hasonló magasságú csúcs között a felbontást (R s ) az alábbi képlet alapján számíthatjuk ki: R s 1,18 = w 2 ( t t ) h1 R2 + w h2 R1 t R2 > t R1 t R1 és t R2 = vándorlási idők vagy távolságok, melyeket az alapvonalon, az injektálási pont és a két szomszédos komponens csúcsmaximumából az alapvonalra bocsátott merőlegesek között mérünk, w h1 és w h2 = a csúcsmagasságok felénél mért csúcsszélességek (félértékszélességek). Amennyiben szükséges, a felbontás jellemezhető úgy is, hogy az összehasonlító készítmény elektroforetogramján megmérjük a két, nem teljesen elvált csúcs közti völgy magasságát (h v ) és a kisebbik csúcs magasságát (h p ), majd kiszámítjuk a hegy völgy arányt (peak-to-valley ratio): H p p / v =. H v SZIMMETRIAFAKTOR Egy csúcs szimmetriafaktorát (A s ) az alábbi összefüggés alapján számíthatjuk ki: w0,05 A s =, 2d

12 Kapilláris elektroforézis Ph.Hg.VIII. Ph.Eur w 0,05 = a csúcsmagasság huszadánál mért csúcsszélesség, D =a csúcsmaximumból az alapvonalra bocsátott merőleges és a csúcs felszálló ága között, a magasság huszadánál mért távolság. A terület ismételhetősége (azaz a területek, vagy a terület/vándorlási idő hányadosok szórása) és a vándorlási idő ismételhetősége (azaz a vándorlási idő szórása) rendszeralkalmassági jellemzők. A vándorlási idő ismételhetőségének vizsgálata egyúttal a kapillárismosási eljárás alkalmasságának vizsgálata is. A vándorlási idő rossz ismételhetősége úgy is elkerülhető, hogy a vándorlási időket belső standardra vonatkoztatjuk. A rokon vegyületek meghatározásához hasznos lehet, ha egy standard készítménnyel a megkövetelt jel/zaj arányt (vagy a mennyiségi meghatározás alsó határát) igazoljuk. JEL/ZAJ VISZONY A kimutatási határ 3, a mennyiségi meghatározás alsó határa 10 jel/zaj aránynak felel meg. A jel/zaj viszony (S/N) az alábbi összefüggés szerint számítható: 2H S / N =, h H =az előírt összehasonlító oldat elektroferogramján, a vonatkozó csúcs magassága, melyet a csúcs maximuma és az extrapolált alapvonal között mérünk. Az alapvonal meghatározásához a detektorjelet a csúcs félértékszélességének hússzorosáig követjük. h =a háttérzaj sávszélessége az üres oldat injektálásával nyert elektroferogramon; amennyiben lehetséges, az elektroferogram azon részén mérjük, a csúcs az előírt összehasonlító oldat elektroferogramján eluálódna. A sávszélesség meghatározásához a detektorjelet a csúcs elméleti eluálódási helye előtt és után azonos ideig, az előírt összehasonlító oldat elektroferogramján kapott csúcs félértékszélességének hússzorosáig követjük.