ELEKTROFORÉZIS (1)

Átírás

1 Elektroforézis Ph.Hg.VIII. Ph.Eur ELEKTROFORÉZIS (1) 01/2010:20231 ALAPELVEK Elektromos erőtér hatására az elektrolit oldatban oldott vagy diszpergált, töltéssel rendelkező részecskék az ellentétes töltésű elektród felé vándorolnak. A gélelektroforézis esetében a részecskéket körülvevő, molekulaszűrőként viselkedő gélmátrix akadályozza a részecskék haladását. Az egymással ellentétes kölcsönhatások (az elektromos erőtér hatása és a molekulaszűrő hatás) eredményeképpen a részecskék vándorlási sebessége méretük, alakjuk és töltésük szerint különböző. Különböző fizikai-kémiai tulajdonságaik miatt egy keverék különböző makromolekulái az elektroforézis ideje alatt különböző sebességgel fognak vándorolni, és így elkülönülő frakciókra válnak szét. Az elektroforetikus elválasztás megvalósítható hordozó anyag nélküli rendszerben (például szabadoldatos elválasztás a kapilláris elektroforézisben) és stabilizáló közegben, mint vékonyréteg lemezen, filmen vagy gélben. SZABAD VAGY MOZGÓ HATÁRFELÜLETŰ ELEKTROFORÉZIS Ezt az eljárást, mely során a kísérleti jellemzők közvetlenül mérhetők és jól reprodukálhatók, főként a mozgékonyság meghatározására használjuk. Elsősorban nagy relatív molekulatömegű és rosszul diffundáló anyagok vizsgálhatók ilyen módon. A vizsgálat elején fizikai módszerrel pl. refraktometriásan vagy konduktometriásan megállapítjuk a határvonalak helyét. Ezután meghatározott erősségű elektromos teret hozunk létre, majd pontosan mért idő elteltével megállapítjuk az újonnan kialakult határfelületek helyzetét. A kísérleti körülményeket úgy kell megválasztani, hogy a határfelületek száma megegyezzen a komponensek számával. HORDOZÓANYAGGAL VÉGZETT ZÓNAELEKTROFORÉZIS E vizsgálathoz igen kis mennyiségű anyagra van szükség. A hordozó pl. papír, agar-agar gél, cellulóz-acetát, keményítő, agaróz, metakrilamid, gélkeverék tulajdonságai további tényezőkkel befolyásolják a mozgékonyságot: a) a hordozó pórusaiban történő haladás következtében a látszólag megtett út rövidebb, mint a ténylegesen megtett út, b) a hordozók egy része elektromosan nem semleges, emiatt mivel a hordozó állófázist képez esetenként jelentős elektroendozmotikus (vagy más néven elektroozmotikus) áramlás alakulhat ki, (1) Ez a fejezet gyógyszerkönyvi harmonizációs eljáráson esett át. Lásd 5.8 Gyógyszerkönyvi harmonizáció (9.18) c. fejezetet.

2 Elektroforézis Ph.Hg.VIII. Ph.Eur c) a Joule-effektus okozta melegedés következtében a hordozó felületén kismértékű folyadékpárolgás zajlik, és ez a kapillaritás következtében oda vezet, hogy az oldat a végek felől a centrum felé vándorol, és ezért az ionerősség fokozatosan növekszik. A vándorlási sebesség tehát négy fő tényezőtől függ: a töltéssel rendelkező részecske mozgékonyságától, az elektroozmotikus áramlástól, a párolgás okozta áramlástól és a térerősségtől. Ezért a vizsgálatokat pontosan előírt körülmények között kell végezni, lehetőleg összehasonlító anyagok alkalmazásával. A készülék részei: egyenáramú áramforrás, szabályozható és lehetőleg stabilizált feszültséggel, elektroforézis kamra, amely általában téglaalakú, üvegből vagy kemény műanyagból készült és az anód valamint a katód befogadására két, elektrolit oldatot tartalmazó elkülönített térrel rendelkezik. A két térbe egy-egy elektród pl. platina- vagy grafitelektród merül. Az elektródok kellőképpen szigetelt vezetékeken keresztül csatlakoznak az áramforrás megfelelő pólusához. Az ún. szifonhatás elkerülése érdekében biztosítani kell, hogy a két elektródtérben a folyadékszint a vizsgálat befejezéséig azonos maradjon. Az elektroforézis-kamrához légmentesen záró fedél tartozik, amely a vizsgálat folyamán telített gőzteret biztosít, és csökkenti az oldószer párolgását. Az áramkörbe ajánlatos beiktatni egy árammegszakító biztonsági rendszert, amely a fedél felnyitásakor lép működésbe. Amennyiben a hordozósávokon mért elektromos teljesítmény meghaladja a 10 W-ot, célszerű gondoskodni a hordozó hűtéséről. hordozótartó eszköz: Sávelektroforézishez a hordozósávot előzőleg átnedvesítjük az elektrolit-oldattal, két végét a megfelelő elektród-kamrába merítjük, majd alkalmas eszköz segítségével megfelelően kifeszítjük és rögzítjük. Az eszközt amely lehet pl. egy megfelelő távolságban érintkezési pontokkal ellátott vízszintes keret, fordított-v alakú állvány vagy sima lap úgy alakítják ki, hogy az elektrolit diffúzióját megakadályozza. Gélelektroforézis esetében a tartóeszköz lényegében egy üveglemez (pl. egy mikroszkóp-tárgylemez), amelynek egész, felső felülete egyenletes vastagságú, erősen tapadó gélréteggel van bevonva. A gél és az elektrolit-oldat közti érintkezés létesítésére a készülék típusától függően többféle megoldás alkalmazható. Óvintézkedéseket kell tennünk egyrészt a nedvesség lecsapódásának megakadályozására, másrészt a hordozó kiszáradásának elkerülésére. eszköz a detektáláshoz ill. a kiértékeléshez. Vizsgálat. Az elektrolit-oldatot az elektródkamrákba töltjük. Az elektrolittal megfelelően impregnált hordozót a készülék típusára vonatkozó előírások szerint elhelyezzük a kamrában. Bejelöljük a startvonalat, és felvisszük az anyagot. Az előírt időtartamra áram alá helyezzük a készüléket. Az áram kikapcsolása után a hordozót kiemeljük a kamrából, megszárítjuk és előhívjuk. POLIAKRILAMID-RÚD GÉLELEKTROFORÉZIS

3 Elektroforézis Ph.Hg.VIII. Ph.Eur A poliakrilamid-rúd gél elektroforézishez akrilamid és N,N'-metilén-biszakrilamid keverékéből készült gélt alkalmazunk állófázisként. A gélrudakat 7,5 cm hosszú és 0,5 cm belső átmérőjű csövekben állítjuk elő; egy-egy ilyen gélrúdra csak egyetlen oldatot vihetünk fel. Készülék. Két, megfelelő anyagból [pl. poli(metil-metakrilátból)] készült tartály szolgál a tompítóoldatok befogadására; a tartályok egymás felett helyezkednek el, és mindkettőbe egy-egy platinaelektród merül. Az elektródok olyan áramforráshoz csatlakoznak, amely lehetővé teszi, hogy az elektroforézist állandó áramerősség vagy állandó feszültség alkalmazásával hajtsuk végre. A felső kamra alján, az elektródtól egyforma távolságban, alkalmas helyek vannak kiképezve a gélrudak elhelyezésére. Vizsgálat. Az oldatokat a polimerizáció előtt rendszerint gázmentesíteni kell, és a géleket elkészítésük után azonnal fel kell használni. A gél-keveréket az előírt módon elkészítjük és alul dugóval lezárt, alkalmas üvegcsövekbe öntjük. Az üvegcsöveket felső szélük alatt kb. 1 cm-nyi szabad helyet hagyva egyforma magasan, buborékmentesen töltjük meg a keverékkel, majd a levegővel való érintkezés elkerülése érdekében R vizet rétegzünk fölé, és állni hagyjuk. Amikor a gélesedés befejeződött (általában kb. 30 perc), amit az jelez, hogy a gél és a vízréteg között éles határfelület jött létre, a vízréteget eltávolítjuk a dugókat. Az üvegcsöveket ezután a felső tartályban található tartókba helyezzük, olymódon, hogy aljuk az alsó tartályban lévő tompítóoldatba merüljön. Ezután a csöveket óvatosan feltöltjük az előírt tompítóoldattal. Elkészítjük az előírás szerinti jelzőszínezéket tartalmazó vizsgálati- és összehasonlító oldatokat, és pl. R szacharóz hozzáadásával sűrűségüket megnöveljük. Az oldatokat felvisszük a gélrudak felszínére (minden oszlopra külön oldatot). A tompítóoldatot a felső tartályba is betöltjük. Az elektródok áramforrásra kapcsolásával az előírt hőmérsékleten, az előírt állandó feszültség vagy állandó áramerősség alkalmazásával megindítjuk az elektroforézist. Amint a jelzőszínezék elérte az alsó tartályt, kikapcsoljuk a készüléket. A csöveket haladéktalanul kiemeljük, és a gélrudakat kitoljuk a csövekből. A sávok helyzetét az elektroferogramon az előírt módon állapítjuk meg. NÁTRIUM-DODECIL-SZULFÁT POLIAKRILAMID ELEKTROFORÉZIS (SDS- PAGE) Alkalmazási terület. A poliakrilamid gél elektroforézist biológiai készítmények fehérjetartalmának minőségi jellemzésére, a tisztaság ellenőrzésére és mennyiségi meghatározásra használjuk. Cél. Az analitikai gélelektroforézis olyan módszer, mely alkalmas a gyógyszerkészítmények fehérjéinek azonosítására és homogenitásának megállapítására. A módszert rutinszerűen alkalmazzák a fehérje alegységek molekulatömegeinek becslésére és a tisztított fehérjék alegység-összetételének meghatározására. A jelen fejezetben előírtak helyett a könnyen hozzáférhető, kereskedelemben kapható előregyártott gélek és reagensek is használhatók, feltéve, hogy az előírt gélekkel és reagensekkel megegyező eredményt adnak, és megfelelnek a későbbiekben a Vizsgálat validálása részben előírt validációs követelményeknek.

4 Elektroforézis Ph.Hg.VIII. Ph.Eur A POLIAKRILAMID GÉLEK JELLEMZÉSE A poliakrilamid gélek szűrési tulajdonságát szálak és pórusok háromdimenziós hálózata határozza meg, mely úgy alakul ki, hogy a szomszédos poliakrilamid láncok között a két funkciós csoporttal rendelkező biszakrilamid keresztkötéseket létesít. A polimerizációt ammónium-perszulfátból és tetrametiléndiaminból álló szabadgyök-képző rendszer katalizálja. Az akrilamid koncentrációjának növekedésével a gél effektív pórusmérete csökken. A gél effektív pórusméretét a gyakorlatban a szűrőképességével definiáljuk; ez utóbbit pedig azzal, hogy mekkora ellenállást fejt ki a makromolekulák migrációjával szemben. Az akrilamid koncentrációját csak bizonyos határok között lehet változtatni. Magas akrilamid koncentráció esetén a gél sokkal törékenyebb lesz, és kezelése is nehezebb. A gél pórusméretének csökkenésével a fehérjék gélen keresztüli vándorlási sebessége csökken. Adott fehérjekészítmény esetén a gél pórusméretének módosításával azaz az akrilamid koncentráció változtatásával a módszer felbontása optimalizálható. Így egy adott gél az akrilamid és a biszakrilamid koncentrációjának megadásával fizikailag jellemezhető. Az elektroforetikus mozgékonyságot a gél összetételén kívül a fehérje állapota is nagymértékben befolyásolja. A fehérjék esetében az elektroforetikus mozgékonyság függ a töltéssel rendelkező csoportok pk értékétől és a molekula méretétől. Hatással van rá a tompítóoldat minősége, koncentrációja és ph-ja, a hőmérséklet, az elektromos térerősség, csakúgy, mint a hordozóanyag típusa. DENATURÁLÓ POLIAKRILAMID GÉLELEKTROFORÉZIS Az itt bemutatott módszer a dalton tömegű monomer polipeptidek analízisére korlátozódik. Különböző technikák (pl. gradiens gélek, különleges tompítóoldat rendszer) alkalmazásával a tömegtartomány kiterjeszthető, de ezeket a módszereket ebben a fejezetben nem tárgyaljuk. A nátrium-dodecil-szulfátot alkalmazó denaturáló poliakrilamid gél elektroforézis (SDS-PAGE) a fehérjekészítmények gyógyszerminőségének megállapítására legáltalánosabban alkalmazott elektroforézis módszer. A következőkben ezt mutatjuk be. Általában a fehérjék poliakrilamid gélekben végzett analitikai célú elektroforézisekor a körülményeket úgy választják meg, hogy biztosított legyen a fehérje egyedi polipeptid alegységeire történő disszociációja, és minimális legyen az aggregáció. A gélre töltés előtt a fehérjék disszociációját legáltalánosabban nátrium-dodecil-szulfát (SDS) mely erősen anionos felületaktív anyag (detergens) és hő együttes alkalmazásával érik el. Az SDS a denaturálódott polipeptidekhez kötődik, így azok töltése negatív lesz, és állandó, a fehérje típusától független töltés/tömeg arány alakul ki. Mivel a kötődött SDS mennyisége majdnem mindig arányos a peptid molekulatömegével, és független annak szekvenciájától (aminosav sorrendjétől), az SDS-polipeptid komplexek a poliakrilamid gélen keresztül a polipeptid méretétől függő mozgékonysággal vándorolnak. Minden egyes képződött detergens-polipeptid komplex elektroforetikus mozgékonysága és molekulatömege között ugyanaz a gyakorlati összefüggés áll fenn. Az SDS komplexek vándorlása az anód felé előre jelezhető, a kis molekulatömegű komplexek gyorsabban vándorolnak, mint a nagyobbak. Emiatt kalibrált SDS-PAGE esetén a fehérje

5 Elektroforézis Ph.Hg.VIII. Ph.Eur molekulatömege a relatív mozgékonysága alapján megbecsülhető. Ilyen gélekben egyetlen sáv jelenléte a tisztaság egyik követelménye. A polipeptid lánc módosítása, így az N- vagy O-glikozilálás, szignifikáns hatással van a fehérje látszólagos molekulatömegére, mivel az SDS a szénhidrát csoportokhoz nem ugyanúgy kötődik, mint a polipeptidekhez. Ezekben az esetekben az állandó töltés/tömeg arány nem áll fenn, így a poszt-transzlációs változáson átesett fehérjék látszólagos molekulatömege nem tükrözi a polipeptid lánc valódi tömegét. Redukáló körülmények. A fehérjék háromdimenziós szerkezetét és a polipeptid alegységek kapcsolatát gyakran diszulfid hidak tartják fenn. A redukáló körülmények között végzett SDS-PAGE analízis célja, hogy a diszulfid kötések redukálásával megbontsa ezt a szerkezetet. A fehérjék 2-merkaptoetanolos vagy ditiotreitolos (DTT) kezelés hatására bekövetkező teljes denaturálódása és disszociációja a polipeptid váz szétnyílását, majd ezt követően az SDS-polipeptid komplex kialakulását eredményezi. Ilyen körülmények között megfelelő molekulatömeg standardok jelenlétében lineáris regresszióval a polipeptid alegységek molekulatömege számolható ki. Nem redukáló körülmények. Néhány meghatározásnál a fehérje peptid-alegységekre történő teljes disszociációja nem kívánatos. A redukálószerek (2-merkaptoetanol vagy DTT) távollétében a diszulfid kovalens kötések sértetlenek maradnak, így a fehérje oligomer formája megmarad. Az oligomer SDS-fehérje komplexek sokkal lassabban vándorolnak, mint SDS-polipeptid alegységeik. Ráadásul a nem redukált fehérjék teljesen nem telíthetők SDS-sel, és így nem kötődhet a detergens állandó tömegarányban. Emiatt az ilyen molekulák molekulatömegének SDS-PAGE-val történő meghatározása kevésbé célravezető, mint a teljesen denaturált polipeptidek analízise, mivel ebben az esetben az összehasonlíthatósághoz az is szükséges, hogy mind a standard, mind az ismeretlen fehérje konfigurációja hasonló legyen. A fehérje tisztaságának kritériuma ezekben a gélekben is egyetlen sáv festődése. A NEM-FOLYTONOS TOMPÍTÓOLDAT RENDSZERŰ GÉLELEKTROFORÉZIS JELLEMZÉSE A fehérjék összetett keverékeinek jellemzésére legáltalánosabban alkalmazott elektroforetikus módszer nem-folytonos tompítóoldat rendszert alkalmaz, amely két érintkező de elkülönülő gélből áll: egy felbontó vagy elválasztó (alsó) gélből és egy dúsító (felső) gélből. A két gél porozitása, ph-ja, ionerőssége eltérő. Ráadásul különböző ionokat használnak a gél és az elektródtér tompítóoldataiban. A nem-folytonos tompítóoldat rendszer úgy működik, hogy a nagy térfogatú minta koncentrálódik a dúsítógélben, és ez jobb felbontást eredményez. Az áram rákapcsolásakor a mintaoldatban kialakuló feszültségesés a fehérjéket a dúsítógélbe hajtja. Az elektródtér tompítóoldatának glicinátionjai követik a fehérjéket a dúsító gélbe. Gyorsan kialakul egy mozgó határréteg, melynek elején a nagy mozgékonyságú kloridionok, végén a viszonylag lassú glicinátionok találhatók. Az elülső és a hátramaradó ionok között egy helyi nagy potenciálkülönbségű gradiens alakul ki, mely az SDS-fehérje komplexeket vékony zónába (stack) kényszeríti, és azokat a klorid és a glicinát fázisok között vándoroltatja. Széles határokon belül az alkalmazott minta magasságától függetlenül, minden SDS-fehérje egy igen keskeny zónába tömörül, és az elválasztógélbe jól definiált,

6 Elektroforézis Ph.Hg.VIII. Ph.Eur keskeny és nagy fehérje koncentrációjú zónaként lép be. A nagypórusú dúsítógél a legtöbb fehérje vándorlását nem gátolja, és elsősorban a keveredést megakadályozó közegként működik. A dúsító és az elválasztógél határfelületén a fehérjék visszatartása jelentős mértékben megnő az elválasztógél kis pórusmérete miatt. Az elválasztógélben a fehérjék vándorlásának akadályozása a mátrix szűrőhatása miatt tovább folytatódik. A glicinátionok megelőzik a fehérjéket, melyek ekkor már a trometamol és a glicin által biztosított egyenletes ph-jú térben mozognak. A molekulaszűrő hatás miatt az SDSfehérje komplexek molekulatömegük alapján választódnak el. FÜGGŐLEGES, NEM-FOLYTONOS TOMPÍTÓOLDAT RENDSZERŰ SDS POLIAKRILAMID GÉLEK KÉSZÍTÉSE A gélöntő kazetták összeszerelése. A két üveglapot (méretük például 10 cm 8 cm), a politetrafluoretilén (teflon) fésűt, a két távtartót és a szilikongumi csövet (átmérő például: 0,6 mm 35 cm) enyhe felületaktív anyaggal megtisztítjuk, majd vízzel alaposan leöblítjük. Minden egyes darabot papírtörlővel vagy szövettel megszárítunk. Nem szilikonos zsírral bekenjük a távtartókat és a csövet. A távtartókat az üveglap mindkét rövidebbik oldala és a gél aljának megfelelő hosszabbik oldala mentén a szélektől 2 2 mm-re helyezzük el. Egy távtartót vezetőként használva megkezdjük a cső ráfektetését az üveglapra. A távtartó alján óvatosan meghajlítjuk a csövet, majd követjük az üveglap hosszabbik oldalát. Miközben a csövet egy ujjal a hosszabbik oldalon tartjuk, a csövet újból meghajlítjuk, és a távtartót vezetőként használva a második, rövidebbik oldalra fektetjük. A második üveglapot is elhelyezzük úgy, hogy szélei az elsővel tökéletesen egyvonalban legyenek (egyik irányba se lógjon ki) és az öntőformát kéznyomásunkkal egyben tartjuk. Az öntőforma mindkét rövidebbik oldalára két-két csipeszt, majd óvatosan a forma hosszabbik oldalára négy csipeszt helyezünk fel, ezzel alakítva ki a gélöntő-forma alját. Ellenőrizzük, hogy a cső az üveglapok éle mentén fut, és nem szorítódott ki a csipeszek felhelyezésekor. Ezzel a gélöntő-forma kész a gél beöntésére. A gél készítése. A nem-folytonos tompítóoldatú SDS poliakrilamid géleknél a két gél akrilamid-biszakrilamid összetételének, tompítóoldat típusának és ph-jának különbözősége miatt ajánlatos a formába először az elválasztógélt önteni, megvárni míg az megszilárdul, és csak ezután önteni be a dúsító gélt. Az elválasztógél készítése. A táblázatban megadott adatok alapján egy Erlenmeyer-lombikban megfelelő térfogatú és akrilamid-koncentrációjú oldatot készítünk. A komponenseket a megadott sorrendben keverjük össze. Ahol szükséges, az ammónium-perszulfát oldat és a tetrametiléndiamin (TEMED) hozzáadása előtt az oldatot ha szükséges vákuum segítségével cellulóz-acetát membránon (pórusátmérő 0,45 µm) megszűrjük; a szűrő körkörös mozgatása közben az oldatot addig tartjuk vákuum alatt, míg több buborék már nem képződik benne. Ezután az oldathoz megfelelő mennyiségű ( táblázat) ammónium-perszulfátot és TEMED-et adunk, megkeverjük, majd késedelem nélkül az öntőforma két üveglapja közti résbe öntjük. Hagyjunk elegendő helyet a dúsítógélnek (a fésű fogainak hossza, plusz 1 cm). Elvékonyodó üvegpipettát használva, óvatosan, az oldat fölé vízzel telített izobutanolt rétegzünk. A gélt függőleges helyzetben, szobahőmérsékleten hagyjuk polimerizálódni.

7 Elektroforézis Ph.Hg.VIII. Ph.Eur A dúsítógél készítése. Miután a polimerizáció befejeződött (kb. 30 perc), az izobutanolt leöntjük, és a gél tetejét többször vízzel mossuk, hogy eltávolítsuk az ottmaradt izobutanolt és a nem polimerizálódott akrilamidot. A gél tetejéről amennyire lehetséges a folyadékot leöntjük, majd az esetleg ottmaradt vizet egy papírtörlő szélével felitatjuk. A táblázatban megadott adatok alapján, egy Erlenmeyer-lombikban megfelelő térfogatú és akrilamid-koncentrációjú oldatot készítünk. A komponenseket a megadott sorrendben keverjük össze. Ahol szükséges, az ammónium-perszulfát oldat és a tetrametiléndiamin (TEMED) hozzáadása előtt az oldatot ha szükséges vákuum segítségével cellulóz-acetát membránon (pórusátmérő 0,45 µm) megszűrjük; a szűrő körkörös mozgatása közben az oldatot addig tartjuk vákuum alatt, míg több buborék már nem képződik benne. Ezután megfelelő mennyiségben ( táblázat) ammóniumperszulfátot és TEMED-et adunk hozzá, megkeverjük, majd az oldatot késedelem nélkül az öntőforma két üveglapja közti résbe öntjük közvetlenül a polimerizálódott elválasztógél fölé. Ezután késedelem nélkül, óvatosan, úgy, hogy levegőbuborékok ne szorulhassanak be, tiszta politetrafluoretilén (teflon) fésűt helyezünk a dúsítógél oldatába. További dúsítógél oldat hozzáöntésével a fésű közeit teljesen feltöltjük. A gélt függőleges helyzetben, szobahőmérsékleten hagyjuk polimerizálódni. A gél behelyezése az elektroforézis készülékbe és az elektroforetikus elválasztás. Miután a polimerizáció befejeződött (kb. 30 perc), óvatosan kivesszük a politetrafluoretilén (teflon) fésűt. Az üregeket késedelem nélkül vízzel vagy R SDS- PAGE-hoz szánt futtató tompítóoldattal mossuk, hogy eltávolítsuk a nem polimerizálódott akrilamidot. Ha szükséges, egy fecskendőhöz csatlakoztatott tompa injekcióstű segítségével egyenesítsük ki a dúsítógél fogait. Az egyik rövid oldalon eltávolítjuk a csipeszeket, óvatosan kihúzzuk a csövet, majd visszahelyezzük a csipeszeket. Hasonlóan járunk el a másik rövid oldalon is. A gél aljáról is eltávolítjuk a csövet, majd behelyezzük az elektroforézis készülékbe. A felső és az alsó tartályokba beöntjük az elektroforézishez szükséges tompítóoldatokat. Eltávolítjuk a gél alján az üveglapok között esetlegesen bennszorult levegőbuborékokat. Ezt legkönnyebben egy fecskendőhöz csatlakozatott hajlított injekcióstű segítségével lehet megtenni. A minta betöltése előtt soha se futtassuk a rendszert, mert ez a nem-folytonos pufferrendszert tönkretenné. A minta betöltése előtt R SDS-PAGE-hoz szánt futtató tompítóoldattal gondosan kiöblögetjük a vájatot. A vizsgálati és az összehasonlító oldatokat az ajánlott tompítóoldattal készítjük el, és az egyedi cikkelyben megadottak szerint kezeljük. Mindegyik oldatból megfelelő térfogatot viszünk a dúsítógél mélyedéseibe. Az elektroforézist a készülék gyártója által megadott körülményekkel indítjuk el. Az SDS-PAGE készülékek gyártói különböző felületnagyságú és vastagságú géleket is kínálhatnak. Az optimális elválasztás eléréséhez, ha szükséges, az elektroforézis idejét és az áramerősséget/feszültséget a készülék gyártója által megadottak szerint megváltoztatjuk. Ellenőrizzük, hogy a festékanyag frontja bejutott-e az elválasztógélbe. Amint a festékanyag eléri az elválasztógél alját, leállítjuk az elektroforézist. Kivesszük a gélt a készülékből, és levesszük róla az üveglapokat. Eltávolítjuk a távtartókat, levágjuk majd eldobjuk a dúsítógélt és azonnal megkezdjük a festést. A FEHÉRJÉK DETEKTÁLÁSA A GÉLBEN

8 Elektroforézis Ph.Hg.VIII. Ph.Eur A Coomassie festés a legáltalánosabban alkalmazott fehérjefestési módszer, mellyel sávonként 1 10 µg mennyiségű fehérjét lehet kimutatni. Az ezüst-festés a legérzékenyebb módszer a fehérjék gélen belüli festésére, mellyel ng fehérjét tartalmazó sávok is kimutathatók. A gélfestés minden egyes lépését szobahőmérsékleten, enyhe rázogatás közben (például körkörös rázógéppel), egy erre alkalmas tartályban végezzük. A gélfestés során kesztyűt kell viselni, különben az ujjlenyomatok is megfestődnek. Coomassie festés. A gélt nagy feleslegben lévő R coomassie festőoldatba helyezzük, és legalább 1 órán át benne hagyjuk, majd eltávolítjuk a festőoldatot. A gélből a festéket nagy feleslegben lévő R színtelenítő oldattal mossuk ki. A színtelenítő oldatot többször cseréljük, míg a megfestett fehérjesávok jól elkülönülnek a tiszta háttértől. Minél alaposabban mossuk a gélt, annál kisebb fehérjemennyiség mutatható ki a módszerrel. A festékmentesítés meggyorsítható, ha az R színtelenítő oldatba néhány gramm anioncserélő gyantát, vagy kis szivacsot helyezünk. Megjegyzés: az eljárásban alkalmazott sav-alkohol oldatok a fehérjét nem fixálják teljesen a gélben, ez vékony gélek festése és festékmentesítése során kis molekulatömegű fehérjék esetén anyagveszteséghez vezethet. Tartós fixálást érhetünk el, ha a gélt 1 térfogatrész R triklórecetsav, 4 térfogatrész R metanol és 5 térfogatrész R víz elegyében hagyjuk állni az R Coomassie festő oldatba helyezés előtt. Ezüst-festés. A gélt nagy feleslegben lévő R fixáló oldatba helyezzük és 1 órán át benne hagyjuk. A fixáló oldatot eltávolítjuk, majd friss fixáló oldattal legalább 1 órán át, vagy ha úgy kényelmesebb, egy éjszakán át inkubáljuk. Elöntjük a fixáló oldatot, majd a gélt 1 órán keresztül nagy feleslegű vízzel mossuk. A gélt 15 percig R glutáraldehid 1 %V/V-os oldatában áztatjuk. Ezután a gélt kétszer 15 percig nagy feleslegben lévő R vízzel mossuk, majd sötétben 15 percig friss R ezüst-nitrát reagensbe áztatjuk. A gélt háromszor 5 percig nagy feleslegben lévő R vízzel mossuk, majd kb. 1 percre R előhívó oldatba helyezzük, míg megfelelő festődést érünk el. Az előhívás leállításához a gélt 15 percre R gátló-oldatba merítjük, majd R vízzel öblítjük. A MEGFESTETT POLIAKRILAMID GÉLEK SZÁRÍTÁSA Az alkalmazott festési módszertől függően a géleket kissé eltérő módon kell kezelni. A Coomassie festés esetén a festékmentesítő lépés után a gélt R glicerin 100 g/l töménységű oldatában legalább 2 órán keresztül hagyjuk állni (egy éjszakán át történő inkubáció is lehetséges). Az ezüst-festésnél az utolsó öblítés után a gélt 5 percig R glicerin 20 g/l töménységű oldatába helyezzük. Két ív porózus cellulóz filmet R vízbe helyezünk, és 5 10 percig inkubáljuk. Az ívek egyikét szárító keretre helyezzük. Óvatosan felemeljük a gélt, és a cellulóz filmre helyezzük. Eltávolítjuk a légbuborékokat és néhány milliliter R vizet öntünk a gél szélei köré. Ezután a második ívet a tetejére helyezzük, és eltávolítjuk a levegőbuborékokat. A szárító keretet összeszereljük, majd szárítószekrényben vagy szobahőmérsékleten száradni hagyjuk.

9 Elektroforézis Ph.Hg.VIII. Ph.Eur MOLEKULATÖMEG MEGHATÁROZÁS A fehérjék molekulatömegét úgy határozzuk meg, hogy mozgékonyságukat különböző, ismert molekulatömegű jelzőfehérjék mozgékonyságával hasonlítjuk össze. A gélek kalibrálásához beszerezhető keverékek pontosan ismert molekulatömegű és egyformán festődő fehérjéket tartalmaznak. E keverékek különböző molakulatömeg tartományokban is hozzáférhetők. Az ismert molekulatömegű fehérjék tömény törzsoldatait (alapoldat) a megfelelő tompítóoldattal hígítjuk, és ugyanarra a gélre visszük fel, melyen a fehérje mintát vizsgáljuk. Közvetlenül a futás befejeződése után, a brómfenolkék nyomfesték sávjának helyzetét megjelöljük, hogy így azonosítsuk az elektroforetikus ionfront elejét. Ehhez vagy hornyokat vágunk a gél széleibe vagy egy tusba áztatott tűt szúrunk a gélbe a festékfrontnál. Festés után az elválasztógél tetejétől számítva megmérjük mindegyik fehérje (a jelző és az ismeretlen fehérjék) vándorlási távolságát. Mindegyik fehérje vándorlási távolságát elosztjuk a nyomfesték által megtett úttal. Az így nyert normalizált vándorlási távolságokat a fehérjék relatív mozgékonyságának (relatív a nyomfestékfronthoz képest) nevezzük és megállapodás szerint R F -fel jelöljük. Az R F értékek függvényében ábrázoljuk a fehérje standardok relatív molekulatömegének (M r ) logaritmusát. A kapott görbe kissé szigmoid. Az ismeretlen molekulatömegeket a log M r R F görbéről lineáris regresszióval vagy interpolálással becsüljük meg, ha az ismeretlenre kapott érték a görbe lineáris szakaszára esik. A VIZSGÁLAT VALIDÁLÁSA A vizsgálat csak abban az esetben értékelhető, ha a jelzőfehérjék a gél hosszának 80%-án oszlanak el, és a szükséges elválasztási tartományban (például a terméket és annak dimerjét, vagy a terméket és annak rokon vegyületeit lefedő tartományban) a releváns fehérjékre kapott elválasztás végig lineáris összefüggést mutat a molekulatömeg logaritmusa és az R F érték között. További validálási követelményeket figyelembe véve a vizsgált oldat sajátságait az egyedi cikkelyek írhatnak elő. SZENNYEZŐK MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁSA Ha az egyedi cikkely a szennyezőkre határértéket ad meg, a vizsgálati oldat hígításával olyan összehasonlító oldatot kell készíteni, mely a szennyező határértékének felel meg. Például ha a határérték 5 %, az összehasonlító oldat a vizsgálati oldat hússzoros hígítása. A vizsgálati oldat elektroforetogramján egy szennyező sávja (a fő sáv kivételével bármely sáv) sem lehet intenzívebb, mint az összehasonlító oldat elektroforetogramján látható fő sáv. Validált körülmények között integráló denzitométert alkalmazva a szennyezők mennyiségi meghatározása történhet a fő csúcsra történő normalizálással. Ebben az esetben a detektor-válasz linearitását igazolni kell. Oldat összetevők Az összetevők térfogata (ml) a gél térfogatának függvényében

10 Elektroforézis Ph.Hg.VIII. Ph.Eur ml 10 ml 15 ml 20 ml 25 ml 30 ml 40 ml 50 ml 6 % akrilamid R víz 2,6 5,3 7,9 10,6 13,2 15,9 21,2 26,5 akrilamid oldat (1) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 8,0 10,0 1,5 M Tris (ph 8,8) (2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 TEMED (5) 0,004 0,008 0,012 0,016 0,02 0,024 0,032 0,04 8 % akrilamid R víz 2,3 4,6 6,9 9,3 11,5 13,9 18,5 23,2 akrilamid oldat (1) 1,3 2,7 4,0 5,3 6,7 8,0 10,7 13,3 1,5 M Tris (ph 8,8) (2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 TEMED (5) 0,003 0,006 0,009 0,012 0,015 0,018 0,024 0,03 10 % akrilamid R víz 1,9 4,0 5,9 7,9 9,9 11,9 15,9 19,8 akrilamid oldat (1) 1,7 3,3 5,0 6,7 8,3 10,0 13,3 16,7 1,5 M Tris (ph 8,8) (2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 TEMED (5) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02 12 % akrilamid R víz 1,6 3,3 4,9 6,6 8,2 9,9 13,2 16,5 akrilamid oldat (1) 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 16,0 20,0 1,5 M Tris (ph 8,8) (2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 TEMED (5) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02 14 % akrilamid R víz 1,4 2,7 3,9 5,3 6,6 8,0 10,6 13,8 akrilamid oldat (1) 2,3 4,6 7,0 9,3 11,6 13,9 18,6 23,2 1,5 M Tris (ph 8,8) (2) 1,2 2,5 3,6 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 TEMED (5) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02 15 % akrilamid R víz 1,1 2,3 3,4 4,6 5,7 6,9 9,2 11,5 akrilamid oldat (1) 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 20,0 25,0 1,5 M Tris (ph 8,8) (2) 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 10,0 12,5 TEMED (5) 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,016 0,02 (1) akrilamid oldat: R akrilamid (30%) biszakrilamid (29:1) oldat (2) 1,5 M Tris (ph 8,8): R 1,5 M trometamol-hidroklorid tompítóoldat (ph 8,8) (3) 100 g/l SDS: R nátrium-dodecil-szulfát 100 g/l töménységű oldata (4) 100 g/l APS: R ammónium-perszulfát 100 g/l töménységű oldata. Az ammónium-perszulfát biztosítja az akrilamid és a biszakrilamid polimerizációjához szükséges szabad gyököket. Mivel az ammónium-perszulfát oldat lassan bomlik, hetente friss oldatot kell készíteni. (5) TEMED: R tetrametiletiléndiamin táblázat Az elválasztógél készítése Oldat összetevők Az összetevők térfogata (ml) a gél térfogatának függvényében 1 ml 2 ml 3 ml 4 ml 5 ml 6 ml 8 ml 10 ml R víz 0,68 1,4 2,1 2,7 3,4 4,1 5,5 6,8 akrilamid oldat (1) 0,17 0,33 0,5 0,67 0,83 1,0 1,3 1,7

11 Elektroforézis Ph.Hg.VIII. Ph.Eur ,0 M Tris (ph 6,8) (2) 0,13 0,25 0,38 0,5 0,63 0,75 1,0 1, g/l SDS (3) 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,08 0,1 100 g/l APS (4) 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,08 0,1 TEMED (5) 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006 0,008 0,01 (1) akrilamid oldat: R akrilamid (30%) bisz-akrilamid (29:1) oldat (2) 1,0 M Tris (ph 6,8): R 1 M trometamol-hidroklorid tompítóoldat (ph 6,8) (3) 100 g/l SDS: R nátrium-dodecil-szulfát 100 g/l töménységű oldata (4) 100 g/l APS: R ammónium-perszulfát 100 g/l töménységű oldata. Az ammónium-perszulfát biztosítja az akrilamid és a biszakrilamid polimerizációjához szükséges szabad gyököket. Mivel az ammónium-perszulfát oldat lassan bomlik, hetente friss oldatot kell készíteni. (5) TEMED: R tetrametiletiléndiamin táblázat A dúsítógél készítése