INTERFERONI GAMMA-1B SOLUTIO CONCENTRATA. Tömény gamma-1b-interferon-oldat

Átírás

1 01/2008:1440 javított 7.0 INTERFERONI GAMMA-1B SOLUTIO CONCENTRATA Tömény gamma-1b-interferon-oldat C 734 H 1166 N 204 O 216 S 5 M r DEFINÍCIÓ A tömény gamma-1b-interferon-oldat a gamma interferon N-terminális metionint tartalmazó formájának oldata. Ezt a fehérjét antigén által stimulált humán T-sejtek termelik és választják ki vírusfertőzések és egyéb indukáló tényezők hatására. Specifikus immunmoduláló tulajdonsága van, így pl. hatékonyan aktiválja a fagocita sejteket. A fehérje két azonos monomer nem kovalensen kapcsolódó dimerjéből áll. A monomer összetétele a következő: QDPYVKEALKKYFNAGDVADNGTLGILKNW EN HS FL KEES M DRKIMQSQ SFYFKLFK IV NF KDDQSIQK ETIKEDM SV NVK FFNSNKKK DFEKLTNY TDLNVQRKHELIQVM RD SV AI AEL SPAAKTGK RSQMLFRG RK R A gamma-1b-interferon hatóértéke legalább NE/mg fehérje. A tömény gamma-1b-interferonoldat milliliterenkénti gamma-1b-interferon tartalma legalább NE. ELŐÁLLÍTÁS A tömény gamma-1b-interferon-oldatot rekombináns DNS technológián alapuló módszerrel baktériumokban termelik. A gyártási körülményeket úgy kell kialakítani, hogy a mikrobiológiai szennyezés minimális legyen. A tömény gamma-1b-interferon-oldatnak meg kell felelnie továbbá az alábbi követelményeknek is. Gazdasejt eredetű fehérjék. A határértéket az illetékes hatóság állapítja meg. Gazdasejt és vektor eredetű DNS. A határértéket az illetékes hatóság állapítja meg. SAJÁTSÁGOK Tiszta, színtelen vagy enyhén sárgás színű folyadék.

2 AZONOSÍTÁS A. A készítmény rendelkezik a várt biológiai aktivitással (lásd a Tartalmi meghatározás részt). B. Megvizsgáljuk A gamma-1b-interferon molekulatömegétől eltérő molekulatömegű szennyezők vizsgálat során kapott elektroferogramokat. A vizsgálati oldattal kapott elektroferogram fősávjának helyzete egyezzen meg az a) összehasonlító oldattal kapott elektroferogram fősávjának helyzetével. C. Peptidtérkép-vizsgálatot végzünk. A-oldat. Literenként 1,2 g R trometamolt, 8,2 g R vízmentes nátrium-acetátot és 0,02 g R kalciumkloridot tartalmazó oldatot készítünk, majd R hígított ecetsavval az oldat ph-ját 8,3-re (2.2.3) állítjuk be. Az oldathoz annyi R poliszorbát 20-at elegyítünk, hogy koncentrációja 0,1 %V/V legyen. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó készítmény 1 mg fehérjét tartalmazó térfogatát alkalmas eljárással sómentesítjük. Alkalmas eljárás lehet pl. az, hogy az oldatot mikrocentrifuga csőbe szűrjük és 500 µl A-oldattal feloldjuk. Az oldathoz R peptidtérkép-vizsgálatra szánt tripszin R vízzel frissen készített, 1 mg/ml töménységű oldatának 10 µl-ét adjuk, és a folyadékot a cső megfordításával finoman összekeverjük. A cső tartalmát 24 órán keresztül C-on inkubáljuk, majd a hidrolizált mintához ml-enként 100 µl R tömény foszforsavat elegyítünk, és a cső megfordításával finoman összekeverjük. Összehasonlító oldat. A vizsgálati oldattal egyidejűleg, azonos módon készítjük, de a készítéshez CRS gamma-1b-interferon R vízzel készült és 1 mg/ml töménységűre hígított oldatát használjuk. Folyadékkromatográfia (2.2.29). 0,15 m hosszú és 4,6 mm belső átmérőjű, R kromatográfiás célra szánt oktadecilszililezett szilikagéllel (10 µm) töltött rozsdamentes acél oszlop, mozgófázis (áramlási sebessége 1,0 ml/perc): A-mozgófázis (0,05 M nátrium-foszfát tompítóoldat (ph 3,3)). I. oldat: 7,80 g R nátriumdihidrogén-foszfát-dihidrátot R vízzel 1000,0 ml-re oldunk. II. oldat: 0,33 ml R tömény foszforsavat R vízzel 100,0 ml-re hígítunk. 920 ml I. oldatot 80 ml II. oldattal elegyítünk. Szükség esetén módosítjuk az oldat ph-ját (2.2.3). B-mozgófázis. R kromatográfiás célra szánt acetonitril. A kromatografálást a következőképpen végezzük (szükség esetén a gradiens módosítható azért, hogy a hidrolizátumban lévő peptidek jobban elváljanak): Idő (perc) A- mozgófázis B-mozgófázis detektorként 214 nm-en regisztráló spektrofotométert használunk. Az oszlop hőmérsékletét 40 C-on tartjuk. Az oszlop egyensúlyát a mozgófázis kezdeti összetételének legalább 15 perces áramoltatásával állítjuk be. Az elválasztás előtt vakpróbát végzünk a fent említett gradienssel.

3 Az oszlopra 100 µl vizsgálati oldatot és 100 µl összehasonlító oldatot injektáljunk. A vizsgálat csak abban az esetben értékelhető, ha mindkét oldat kromatogramja hasonló a megfelelő CRS gamma- 1b-interferonhoz mellékelt kromatogramhoz. A vizsgálati oldat kromatogramjának profilja feleljen meg az összehasonlító oldattal kapott kromatogram profiljának. D. N-terminális szekvenciaanalízist végzünk. Az eljáráshoz automatizált, szilárd fázisú szekvenáló berendezést használunk, a gyártó utasításainak figyelembevételével. Megfelelő módszer alkalmazásával beállítjuk az egyensúlyt 100 µg-nak megfelelő gamma 1binterferonra, R ammónium-hidrogén-karbonát (ph 9,0) 10 g/l töménységű oldatával. Minden szekvenáló ciklus után fordított fázisú folyadékkromatográfiával azonosítjuk a felszabadított feniltiohidantoin(pth)-aminosavakat. A PTH-aminosavak elválasztását a szekvenáló berendezés gyártója által javasolt oszlop és reagensek használatával végezhetjük. Az elválasztási eljárást a következők felhasználásával kalibráljuk: a gyártó által rendelkezésre bocsátott PTH-aminosav-keverékkel, az összes aminosav optimális elválasztására beállított gradiens feltételekkel, minta nélküli szekvenálóciklusból származó, a készülék gyártójának javaslata alapján nyert mintával. Az első 15 aminosav a következő: Met-Gln-Asp-Pro-Tyr-Val-Lys-Glu-Ala-Glu-Asn-Leu-Lys-Lys-Tyr. VIZSGÁLATOK Küllem. A vizsgálandó készítmény tiszta legyen (2.2.1). Színe nem lehet erősebb, mint az S 7 szín mértékoldaté (2.2.2, II. módszer). ph (2.2.3). A vizsgálandó készítmény ph-ja: 4,5 5,5. Kovalens dimerek és oligomerek: legfeljebb 2%. Méretkizárásos kromatográfiás vizsgálatot végzünk (2.2.30). Vizsgálati oldat. A vizsgálandó készítményt a mozgófázissal 0,1 mg/ml töménységűre hígítjuk. Összehasonlító oldat (a). CRS gamma-1b-interferont a mozgófázissal 0,1 mg/ml töménységűre hígítunk. Összehasonlító oldat (b). A következő molekulatömeg standardokból (szarvasmarha albumin, ovalbumin, tripszinogén és lizozim) keveréket készítünk úgy, hogy mindegyik összetevő koncentrációja 0,1 0,2 mg/ml legyen. 0,3 m hosszú, 7,8 mm belső átmérőjű, molekulatömegű globuláris fehérjék elválasztására alkalmas R kromatográfiás célra szánt hidrofil szilikagéllel (5 µm) töltött rozsdamentes acél oszlop, mozgófázis (0,2 M nátrium-foszfát tompítóoldat, ph 6,8): I. oldat: 31,2 g R nátrium-dihidrogénfoszfát-dihidrátot és 1,0 g R nátrium-dodecil-szulfátot R vízzel 1000,0 ml-re oldunk. II. oldat: 28,4 g R vízmentes-dinátrium-hidrogén-foszfátot és 1,0 g R nátrium-dodecil-szulfátot R vízzel 1000,0 ml-re oldunk. 450 ml I. oldatot 550 ml II. oldattal elegyítünk. Szükség esetén módosítjuk az oldat ph-ját (2.2.3). Áramlási sebesség: 1,0 ml/perc. detektor: nm-en regisztráló spektrofotométer. Minden oldatból 200 µl-t injektálunk. Az eljárás csak abban az esetben értékelhető, ha a b) összehasonlító oldat molekulatömeg standard komponensei megfelelő mértékben elváltak, és az a) összehasonlító oldat kromatogramján megjelenő főcsúcs retenciós ideje a b) összehasonlító oldat

4 kromatogramján a tripszinogén és a lizozim csúcsokra meghatározott retenciós idők közé esik. Összehasonlítjuk a vizsgálati oldat és az a) összehasonlító oldat kromatogramját. A vizsgálati oldat kromatogramján nem lehetnek olyan csúcsok vagy vállak, melyek az a) összehasonlító oldat kromatogramján nem találhatók meg. Kiszámítjuk a százalékos kovalens dimer- és oligomertartalmat. Monomerek és aggregátumok: legfeljebb 2%. Méretkizárásos kromatográfiás vizsgálatot végzünk (2.2.30). A-oldat. Elkészítjük a következő összetételű oldatot: literenként 0,59 g R borostyánkősavat és 40 g R mannitot tartalmazó oldat, melynek ph-ját R nátrium-hidroxid oldattal 5,0-re állítottuk be (2.2.3). Vizsgálati oldat. A vizsgálandó készítményt az A-oldattal 1 mg/ml fehérje töménységűre hígítjuk. Összehasonlító oldat. CRS gamma-1b-interferont az A-oldattal 1 mg/ml fehérje töménységűre hígítunk. Csúcsfelbontás-ellenőrző oldat. Az A-oldattal 500 µl 0,04 mg/ml R szarvasmarha albumint és 0,2 mg/ml CRS gamma-1b-interferont tartalmazó oldatot készítünk. Az oldatot a készítés után 24 órán belül felhasználjuk. 0,3 m hosszú, 7,8 mm belső átmérőjű, molekulatömegű globuláris fehérjék elválasztására alkalmas R kromatográfiás célra szánt hidrofil szilikagéllel (5 µm) töltött rozsdamentes acél oszlop, mozgófázis: R kálium-klorid 89,5 g/l töménységű oldata (1,2 M); áramlási sebesség 0,8 ml/perc, detektor: 214 nm-en regisztráló spektrofotométer. 20 µl csúcsfelbontás-ellenőrző oldatot injektálunk. A kapott kromatogramon a natív gamma-1binterferon dimerhez tartozó főcsúcs retenciós ideje kb. 10 perc, a szarvasmarha albumin főcsúcsra vonatkoztatott relatív retenciós ideje kb. 0,85. Az eljárás csak abban az esetben értékelhető, ha a szarvasmarha albuminhoz és az gamma-1b-interferonhoz tartozó csúcsok közötti felbontás legalább 1,5. 20 µl vizsgálati oldatot és 20 µl összehasonlító oldatot injektálunk. A kromatogramok főcsúcsai azonos retenciós időket mutatnak. A monomerek és aggregátumok százalékos arányát a vizsgálati oldat kromatogramján a monomercsúcs és a natív gamma-1b-interferon csúcs előtt eluálódó csúcsok területe alapján számítjuk ki, a normalizációs eljárás segítségével, figyelmen kívül hagyva az oldószer eredetű csúcsokat. Dezamidált és oxidált formák, illetve heterodimerek. Folyadékkromatográfiás vizsgálatot végzünk (2.2.29). A dezamidált és oxidált formák mennyisége legfeljebb 10%. A heterodimerek mennyisége legfeljebb 3%. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó készítményt R vízzel 1 mg/ml fehérje töménységűre hígítjuk. Összehasonlító oldat. CRS gamma-1b-interferont R vízzel 1 mg/ml fehérje töménységűre hígítunk. Csúcsfelbontás-ellenőrző oldat. CRS gamma-1b-interferon validáló oldatot használunk. 0,075 m hosszú, és 7,5 mm belső átmérőjű, megfelelő erős kationcserélő hidrofil polimetakrilát géllel (10 µm, 100 nm) töltött rozsdamentes acél oszlop, mozgófázis, 1,2 ml/perc áramlási sebesség mellett: A-mozgófázis (0,05 M ammónium-acetát tompítóoldat, ph 6,5). R ammónium-acetát 3,86 g/l töménységű oldata, amelynek ph-ját R hígított ecetsavval 6,5-re állítjuk be. B-mozgófázis (1,2 M ammónium-acetát tompítóoldat, ph 6,5). R ammónium-acetát 92,5 g/l töménységű oldata, amelynek ph-ját R hígított ecetsavval 6,5-re állítjuk be. A kromatografálást a következőképpen végezzük (szükség esetén, az elválasztás javítása érdekében

5 a gradiens módosítható): Idő (perc) A- mozgófázis B-mozgófázis detektor: 280 nm-en regisztráló spektrofotométer. Az oszlop hőmérsékletét 35 C-on tartjuk. 25 µl csúcsfelbontás-ellenőrző oldatot injektálunk. A kapott kromatogramon a főcsúcs retenciós ideje kb. 26 perc. A dezamidált és oxidált formák együtt eluálódnak, a főcsúcsra vonatkoztatott kb. 0,95 relatív retencióval. Az eljárás csak abban az esetben értékelhető, ha a csúcsfelbontás, amit a dezamidált és oxidált formák csúcsmagasságának és az ezen csúcsot a főcsúcstól elválasztó görbeszakasz minimuma alapvonaltól mért távolságának arányával definiálunk, legalább 1,2. 25 µl vizsgálati oldatot és 25 µl összehasonlító oldatot injektálunk. A kapott kromatogramok főcsúcsai azonos retenciós időket mutatnak. A vizsgálati oldat kromatogramján a százalékos dezamidált és oxidált gamma-1b-interferon-tartalmat a főcsúcs területének százalékában fejezzük ki. A heterodimerek főcsúcsra vonatkoztatott relatív retenciója 0,7 és 0,85. A heterodimerek százalékos tartalmát az összes csúcs területösszegének százalékában számítjuk ki. A gamma-1b-interferon molekulatömegétől eltérő molekulatömegű szennyezők. Poliakrilamid gélelektroforézissel vizsgáljuk (2.2.31). A vizsgálatot redukáló és nem redukáló körülmények között is elvégezzük. Az elválasztáshoz 15 százalékos akrilamid gélt használunk, a detektálást ezüstfestéssel végezzük. Minta tompítóoldat (nem redukáló körülmények). 3,78 g R trometamolt, 10,0 g R nátrium-dodecilszulfátot és 0,100 g R brómfenolkéket R vízben oldunk. Az oldathoz 50,0 ml R glicerint adunk és R vízzel 80 ml-re hígítjuk. Az így kapott oldat ph-ját R tömény sósavval 6,8-re beállítjuk (2.2.3), majd térfogatát R vízzel 100 ml-re kiegészítjük. Minta tompítóoldat (redukáló körülmények). 3,78 g R trometamolt, 10,0 g R nátrium-dodecil-szulfátot és 0,100 g R brómfenolkéket R vízben oldunk. Az oldathoz 50,0 ml R glicerint adunk és R vízzel 80 ml-re hígítjuk. Az így kapott oldat ph-ját R tömény sósavval 6,8-re beállítjuk (2.2.3), majd térfogatát R vízzel 100 ml-re kiegészítjük. Közvetlenül a felhasználás előtt 250 mm végkoncentráció eléréséig R ditiotreitolt adunk az oldathoz. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó készítményt R vízzel 1 mg/ml fehérje töménységűre hígítjuk. Az oldat 150 µl-ét 38 µl minta tompítóoldattal elegyítjük. Összehasonlító oldat (a). A vizsgálati oldattal azonos módon készül, de a vizsgálandó készítmény helyett CRS gamma-1b-interferont használunk. Összehasonlító oldat (b) (5 ng-os ellenőrző oldat). R szarvasmarha albumin 0,01 mg/ml töménységű oldatának 50 µl-ét 2000 µl R vízzel hígítjuk és 450 µl minta tompítóoldatot elegyítünk hozzá. Összehasonlító oldat (c) (2 ng-os ellenőrző oldat). R szarvasmarha albumin 0,01 mg/ml töménységű oldatának 20 µl-ét 2000 µl R vízzel hígítjuk és 450 µl minta tompítóoldatot elegyítünk hozzá. Összehasonlító oldat (d). Az SDS poliakrilamid gélek kalibrálására alkalmas molekulatömeg hitelesítő oldatot használunk, a kda mérettartományban. Az oldatokat tartalmazó kémcsöveket 15 percig szobahőmérsékleten tartjuk, majd jégen tároljuk. Az oldatok 25 µl-ét a dúsítógél mélyedéseibe pipettázzuk. Az elektroforézist a berendezés gyártója

6 által javasolt körülmények között végezzük. A fehérjéket a gélben ezüstfestéssel tesszük láthatóvá. Az eljárás csak abban az esetben értékelhető, ha a validálási feltételek (2.2.31) teljesülnek, és a b) és c) összehasonlító oldatok elektroferogramján még látható festett sáv. A vizsgálati oldat elektroferogramján a fősáv intenzitása egyezzen meg az a) összehasonlító oldat elektroferogramján látható fősáv intenzitásával. A vizsgálati oldat elektroferogramján nem lehetnek olyan jelentős sávok, amelyek nincsenek jelen az a) összehasonlító oldat elektroferogramján (0,01%). Jelentősnek azokat a sávokat tekintjük, amelyek intenzitása nagyobb vagy egyenlő a c) összehasonlító oldat elektroferogramján megjelenő sáv intenzitásával. Norleucin: legfeljebb 0,2 mól norleucin/mól gamma-1b-interferon. Aminosav-analízist végzünk. Vizsgálati oldat. 2,5 ml vizsgálandó készítményt fehérjék sómentesítésére alkalmas oszlopra viszünk, amelyet korábban 25 ml 10 %V/V-os R ecetsavval egyensúlyba hoztunk. A mintát további 2,5 ml 10 %V/V-os R ecetsavval eluáljuk az oszlopról. Az eluátum fehérjetartalmát a Tartalmi meghatározás Fehérje pontjában leírt módon, az abszorbancia mérésével határozzuk meg. Három reakcióedény mindegyikébe 100 µg gamma-1b-interferonnak megfelelő térfogatot pipettázunk, és a mintákat csökkentett nyomáson szárazra párologtatjuk. A három minta hidrolízísét a következő módon végezzük. Minden reakcióedénybe R tömény sósav 50 %V/V-os, 1 %V/V R fenolt tartalmazó oldatának 200 µl-ét mérjük. A mintákat légmentesítjük, nitrogénnel telítjük és a gázfázisban hidrolizáljuk. A reakcióedényeket 22 órán keresztül 110 C-on tartjuk. A hidrolízis után a mintákat csökkentett nyomáson szárazra párologtatjuk. A minták származékképzését a következő módon végezzük. Közvetlenül felhasználás előtt 2 térfogatrész R etanolt, 1 térfogatrész R vizet és 1 térfogatrész R trietil-amint elegyítünk. Ebből az elegyből minden reakcióedénybe 50 µl-t mérünk és az edények tartalmát finoman összerázzuk. A reakcióelegyeket ezután csökkentett nyomáson szárazra párologtatjuk. Ezt követően minden edénybe a következő elegy 50 µl-ét pipettázzuk: 7 térfogatrész R etanol, 1 térfogatrész R víz, 1 térfogatrész R trietil-amin és 1 térfogatrész R fenil-izotiocianát. Az edények tartalmát finoman összerázzuk és szobahőmérsékleten 15 percig állni hagyjuk, majd a mintákat csökkentett nyomáson szárazra párologtatjuk. A mintákat végül 250 µl A-mozgófázisban feloldjuk. Norleucin törzsoldat. R DL-norleucinból 0,01 M sósavval 250 nmol/ml töménységű oldatot készítünk. Az oldat 4 C-on 2 hónapig eltartható. Leucin törzsoldat. R leucinból 0,01 M sósavval 250 nmol/ml töménységű oldatot készítünk. Az oldat 4 C-on 2 hónapig eltartható. Összehasonlító oldat. A három reakcióedény mindegyikében 10 µl norleucin törzsoldatot 100 µl leucin törzsoldattal elegyítünk, majd az oldatokat csökkentett nyomáson szárazra párologtatjuk és elvégezzük rajtuk a Vizsgálati oldat pontban leírt származékképző eljárást. Folyadékkromatogfáfiás vizsgálatot végzünk (2.2.29). 0,15 m hosszú és 3,9 mm belső átmérőjű R kromatográfiás célra szánt oktadecilszililezett szilikagéllel (4 µm) töltött rozsdamentes acél oszlop mozgófázis, áramlási sebessége 1,0 ml/min: A-mozgófázis. R nátrium acetát 19 g/l töménységű, 0,05 %V/V R trietil-amint tartalmazó, R hígított ecetsavval ph 6,4-re beállított oldata (70 térfogatrész) és B-mozgófázis (30 térfogatrész) elegye, B-mozgófázis. 40 térfogatrész R víz és 60 térfogatrész R acetonitril elegye, Idő (perc) A- mozgófázi s B- mozgófázis Megjegyzés

7 izokratikus 7 7, lineáris gradiens 7, mosás 10 10,1 10, lineáris gradiens egyensúly visszaállítása detektor: 254 nm-en regisztráló spektrofotométer. Az oszlop hőmérsékletét 43 C-on tartjuk. Minden oldatból 50 µl-t injektálunk. A vizsgálati oldat kromatogramján azonosítjuk a leucinnak és norleucinnak megfelelő csúcsokat. A norleucin retenciós ideje 6,2 7 perc. A norleucin tartalmat (mól norleucin/mól gamma-1b-interferonban kifejezve) az összehasonlító és a vizsgálati oldatok kromatogramján megjelenő leucin és norleucin csúcsterületekből számítjuk ki, figyelembe véve, hogy a leucin mennyisége 10 mól/1 mól gamma-1b-interferon. Bakteriális endotoxinok (2.6.14): kevesebb, mint 5 NE, NE gamma-1b-interferont tartalmazó térfogatban. TARTALMI MEGHATÁROZÁS Fehérje (2.2.25). A vizsgálandó anyagot R vízzel 1 mg/ml töménységűre hígítjuk. 200 nm és 340 nm között rögzítjük az oldat abszorbciós spektrumát, majd a 280 nm-es maximumon meghatározzuk az oldat abszorbanciáját. Az értéket az oldat zavarosságából származó fényszórással korrigáljuk, a 316 nm-nél mért érték segítségével. A gamma-1b-interferon koncentrációt a fajlagos abszorpciós koefficiens (=7,5) alkalmazásával számítjuk ki. Hatóérték. A gamma-1b-interferon készítmény hatóértékének becsléséhez a vizsgálati gamma-1binterferon-oldat azon hatását mérjük, amely tenyésztett sejtek felszínén fokozza a humán-leukocitaantigén-dr (HLA-DR) kifejeződését. Az eredményt a humán rekombináns gamma interferon megfelelő Nemzetközi Standardja vagy egy Nemzetközi Egységben kalibrált összehasonlító készítmény azonos hatásához hasonlítjuk. A Nemzetközi Egység a megfelelő Nemzetközi Standard meghatározott mennyiségének aktivitása. A Nemzetközi Standard Nemzetközi Egységekben kifejezett értékét az Egészségügyi Világszervezet (WHO) állapítja meg. A tartalmi meghatározást alkalmas módszer segítségével, a következők alapján végezzük: A vizsgálathoz a szokásos körülmények között tenyésztett COLO 205 sejteket használunk. A 3-5 napja tenyésztésben lévő COLO 205 sejtpopulációt tripszinnel kezeljük, és egy 1, sejt/ml töménységű sejtszuszpenziót készítünk. 96 lyukú mikrotiterlemez minden mélyedésébe 100 µl hígító táptalajt mérünk. A vakpróbára szánt mélyedésekhez újabb 100 µl táptalajt adunk. Minden vizsgálandó oldatból 100 µl-t viszünk a lemez egy-egy mélyedésébe, és felező hígítási sort készítünk mindegyikből azért, hogy az adatokból kalibrációs görbéket készíthessünk. Ezután a minden mélyedésbe 100 µl sejtszuszpenziót mérünk, és a lemezt sejttenyésztésre alkalmas körülmények között inkubáljuk.

8 A tenyésztés után a táptalajt eltávolítjuk, a sejteket mossuk és fixáljuk. Minden mélyedésbe a gamma- 1b-interferon hatására termelt HLA-DR kimutatására alkalmas ellenanyagot viszünk, és a lemezt megfelelő körülmények között inkubáljuk. A lemez mosása után az anti-hla-dr ellenanyag kimutatására alkalmas, jelzőenzimhez kapcsolt ellenanyagot viszünk a mélyedésekbe. Inkubálás után a lemezt mossuk és az enzim jelenlétének kimutatására alkalmas szubsztrát oldatot viszünk a mélyedésekbe. A reakciót leállítjuk és megmérjük az oldat abszorbanciáját. A vizsgálandó készítmény hatóértékét az általánosan használt statisztikai módszerek segítségével számítjuk ki. A becsült fajlagos aktivitás a deklarált hatóérték %-a legyen. A becsült hatóérték megbízhatósági intervalluma (P=0,95) % között legyen. ELTARTÁS Légmentesen záró edényben, fénytől védve, 70 C hőmérsékleten.