IMMUNGLOBULIN ANTIKOMPLEMENT- AKTIVITÁSÁNAK VIZSGÁLATA

Átírás

1 vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur IMMUNGLOBULIN ANTIKOMPLEMENT- AKTIVITÁSÁNAK VIZSGÁLATA Az immunglobulin antikomplement-aktivitásának (ACA) méréséhez meghatározott mennyiségű vizsgálati anyagot (10 mg immunglobulint) meghatározott mennyiségű tengerimalackomplementtel (20 CH 50 ) inkubálunk és a megmaradt komplement-aktivitást titráljuk. Az antikomplement-aktivitás a megkötött komplementnek a 100%-nak tekintett komplementkontrollhoz viszonyított, százalékban kifejezett aránya. A komplement-aktivitás (CH 50 ) hemolitikus egysége az a komplement mennyiség, amely az adott kísérleti körülmények között optimálisan szenzibilizált vörösvértestből 2, számúnak a hemolízisét eredményezi. Magnézium-kalcium alapoldat. 1,103 g R kalcium-kloridot és 5,083 g R magnézium-kloridot R vízben 25 ml-re oldunk. Barbitál-tompító alapoldat. 207,5 g R nátrium-kloridot és 25,48 g R barbitál-nátriumot 4000 ml R vízben oldunk és az oldat ph-ját 1 M sósavval 7,3-s értékre állítjuk be. Az oldathoz 12,5 ml magnézium-kalcium alapoldatot elegyítünk és R vízzel 5000 ml-re hígítjuk. Membránszűrőn (pórusméret 0,22 μm) megszűrjük. 4 C-on, üvegedényekben tároljuk. Zselatin oldat. 12,5 g R zselatint kb. 800 ml R vízben oldunk és az oldatot forrásban lévő vízfürdőben felmelegítjük. Ezután 20 C-ra lehűtjük és R vízzel 10 literre hígítjuk. Membránszűrőn (névleges pórusméret 0,22 μm) megszűrjük. 4 C-on tároljuk. Kizárólag tiszta oldatok használhatók. Citrát oldat. 8,0 g R trinátrium-citrátot, 4,2 g R nátrium-kloridot és 20,5 g R glükózt 750 ml R vízben oldunk. Az oldat ph-ját R citromsav 100 g/l töménységű oldatával 6,1 értékre beállítjuk és térfogatát R vízzel 1000 ml-re egészítjük ki. Zselatin-barbitál tompítóoldat. 4 térfogat zselatin oldatot 1 térfogat barbitál-tompító alapoldattal elegyítünk. Szükség esetén az oldat ph-ját 1 M nátrium-hidroxid oldattal vagy 1 M sósavval 7,3 értékre beállítjuk. 4 C-on tároljuk. Az oldatot naponta frissen készítjük. Stabilizált birkavér. 1 térfogat birkavért 1 térfogat citrát oldatban felfogunk és elkeverünk. 4 C-on tároljuk legalább 7, de legfeljebb 28 napig. (Stabilizált birkavér és birka-vörösvérsejt a kereskedelemből beszerezhető.) Hemolizin. Nyulakból nyert birka-vörösvérsejt elleni antiszérum. (Ilyen antiszérum a kereskedelemből beszerezhető.) Tengerimalac-komplement. Legalább tíz tengerimalac véréből készített szérumot egyesítünk. A szérumot a megalvadt vérből kb. 4 C-os hőmérsékleten, centrifugálással különítjük el. Az egyesített szérumot kis részletekben, 70 C alatt tároljuk. VIZSGÁLAT Standardizált, 5%-os birka-vörösvérsejt szuszpenzió készítése. Megfelelő térfogatú, stabilizált birkavérből centrifugálással elkülönítjük a vörösvérsejteket. Legalább háromszor mossuk zselatin-barbitál tompítóoldattal, majd ugyanezen oldattal készítjük el belőle az 5% V/V-os szuszpenziót. A szuszpenzió vérsejtkoncentrációját a következőképpen mérjük: a szuszpenzió 0,2 ml-ét 2,8 ml R vízhez adjuk és a hemolizált oldatot 5 percig 1000 g-vel centrifugáljuk; a vérsejtkoncentráció akkor megfelelő, ha a felülúszó folyadék 541 nm-en mért

2 vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur abszorbanciája (2.2.25) 0,62±0,01. A vérsejtkoncentráció zselatin-barbitál tompítóoldat hozzáadásával a következő képlet alapján korrigálható: V f Vi A = 0,62 V f = a végső, korrigált térfogat, V i = a kiindulási térfogat, A = az eredeti szuszpenzió abszorbanciája 541 nm-en. A standardizált szuszpenzió milliliterenként kb vértestet tartalmaz. A hemolizin titrálása A táblázat alapján elkészítjük a hemolizin-hígításokat. A kívánt hemolizinhígítás Zselatin-barbitáltompítóoldat térfogat (ml) táblázat A készítéshez felhasználandó hígítás (1/...) Hemolizin térfogat (ml) 7,5 0,65 nem hígított 0,1 10 0,90 nem hígított 0,1 75 1,80 7,5 0, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,0 * az elegy 1,0 ml-ét elöntjük. A hemolizin hígítási sorozatot tartalmazó kémcsövek mindegyikéhez, kezdve az 1/75 arányú hígítástól, 1,0 ml 5%-os birka-vörösvérsejt szuszpenziót keverünk. A keverékeket 30 percig 37 C-on inkubáljuk.

3 vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur Az inkubált keverékek mindegyikéből 0,2 ml-t újabb kémcsövekbe mérünk, majd mindegyikhez hozzáadunk 1,10 ml zselatin-barbitál tompítóoldatot és 0,2 ml hígított tengerimalackomplementet (pl. 1/150). Párhuzamosan két sorozatot készítünk. A nem-hemolizált vérsejt-kontrollhoz 3 kémcsövet készítünk elő: mindháromba 1,4 ml zselatinbarbitál tompítóoldatot és 0,1 ml 5%-os birka-vörösvérsejt szuszpenziót mérünk. A teljesen hemolizált kontrollhoz szintén 3 kémcsövet készítünk elő: mindháromba 1,4 ml R vizet és 0,1 ml 5 %-os birka-vörösvérsejt szuszpenziót mérünk. Az összes kémcsövet 37 C-on 60 percig inkubáljuk, majd 1000 g-vel 5 percig centrifugáljuk. A felülúszó folyadékok abszorbanciáját 541 nm-en mérjük (2.2.25). A hemolízis százalékos mértékét az alábbi képlet alapján minden egyes kémcsőre kiszámoljuk: Aa A1 100 A A b 1 A a = a hemolizin-hígításokat tartalmazó kémcsövek tartalmának abszorbanciája, A b = a 3 teljesen hemolizált kontroll oldat átlagos abszorbanciája, A 1 = a 3 nem-hemolizált vérsejt-kontroll átlagos abszorbanciája. Lineáris beosztású milliméter-papíron az ordinátán ábrázoljuk a hemolízis százalékos mértékét a hemolizin-hígítás reciprokának függvényében, mely utóbbit az abszcisszára visszük fel. A görbéből meghatározzuk az optimális hemolizin-hígítást. Kiválasztjuk azt a hígítást, amelynél a hemolizin mennyiségének további növelése már nem befolyásolja észrevehetően a hemolízis mértékét. Ezt a hígítást nevezzük 1 minimális hemolitikus egységnek (1 MHE) 1,0 ml-ben. A szenzibilizált birka-vörösvérsejtek készítéséhez használt optimálisan hemolizáló hemolizinhígítás ml-enként 2 MHE-t tartalmaz. A hemolizin-titrálás csak abban az esetben értékelhető, ha a hemolízis maximális mértéke 50 70%. Amennyiben a hemolízis maximális mértéke ezen a tartományon kívül esik, a titrálást kisebb vagy nagyobb mértékben hígított komplement-oldattal meg kell ismételni. Optimálisan szenzibilizált birka-vörösvérsejtek (hemolitikus rendszer) készítése Milliliterenként 2 MHE-t tartalmazó, hígított hemolizinből megfelelő térfogatú mennyiséget készítünk. Azonos térfogatú standardizált 5%-os birka-vörösvérsejt-szuszpenziót is készítünk. A hemolizin-hígítást a standardizált vörösvérsejt-szuszpenzióhoz keverjük. A keveréket 37 C-on 15 percig inkubáljuk. 2 8 C-on tároljuk és 6 órán belül használjuk fel. A komplement titrálása Megfelelő komplement-hígítást (pl. 1:250) készítünk zselatin-barbitál tompítóoldattal és a táblázat szerint járunk el. Két párhuzamos titrálást végzünk.

4 vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur táblázat Kémcső jelzése A hígított (pl. 1:250) komplement térfogata ml-ben A zselatin-barbitáltompítóoldat térfogata ml-ben 1 0,1 1,2 2 0,2 1,1 3 0,3 1,0 4 0,4 0,9 5 0,5 0,8 6 0,6 0,7 7 0,7 0,6 8 0,8 0,5 9 0,9 0,4 10 1,0 0,3 11 1,1 0,2 12 1,2 0,1 Nem-hemolizált kontroll (három kémcső) 1,3 Teljesen hemolizált kontroll (három kémcső) 1,3 ml víz Mindegyik kémcsőbe 0,2 ml szenzibilizált birka-vörösvérsejtet mérünk, alaposan elkeverjük és 37 C-on 60 percig inkubáljuk. Ezután a kémcsöveket jeges vízben lehűtjük és 1000 g-vel 5 percig centrifugáljuk. A felülúszó folyadék abszorbanciáját 541 nm-en mérjük (2.2.25) és az alábbi összefüggés segítségével kiszámoljuk a hemolízis mértékét (Y): A A c b A1 A 1 A c = az jelzésű kémcsövek tartalmának abszorbanciája, A b A 1 = a teljesen hemolizált kontroll-oldatok átlagos abszorbanciája, = a nem-hemolizált vérsejt-kontrollok átlagos abszorbanciája. Kettős logaritmusos milliméter-papíron az abszcisszára az Y/(1 Y) értékeket visszük fel, az ordinátára pedig a hígított komplement mennyiségét milliliterben. Megrajzoljuk a kapott pontokhoz legjobban illeszkedő egyenest és leolvassuk az Y/(1 Y)=1,0 értéknek megfelelő ordináta-értéket, hogy megkapjuk az 50 %-os hemolízishez tartozó komplement térfogatát. Az alábbi kifejezés alapján kiszámoljuk a hemolitikus egységekben (CH 50 /ml) kifejezett aktivitást: Cd 5C a Cd = a komplement-hígítás reciproka,

5 vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur Ca = az 50%-os hemolízist eredményező hígított komplement térfogata ml-ben, 5 = szorzótényező, a vörösvértestek számának figyelembe vételére. A vizsgálat csak abban az esetben értékelhető, ha az összefüggés a 15%-os és a 85%-os hemolízis közötti szakaszon egyenest ad, melynek meredeksége 0,15 0,40, kedvező esetben 0,18 0,30. Az antikomplement-aktivitás vizsgálata A megtitrált tengerimalac-komplementet zselatin-barbitál tompítóoldattal hígítva 100 CH 50 /ml aktivitású komplement-hígítást készítünk. A vizsgálandó immunglobulintól és a validálási adatoktól függően a vizsgálandó immunglobulin ph-ját szükség esetén 7 értékre beállítjuk. Az 50 mg/ml töménységű immunglobulin-készítmények vizsgálatához a következő inkubációs keverékeket készítjük: táblázat Vizsgálandó immunglobulin Komplement-kontroll (két párhuzamos) Immunglobulin (50 mg/ml) 0,2 ml Zselatin-barbitál tompítóoldat 0,6 ml 0,8 ml Komplement 0,2 ml 0,2 ml Elvégezzük a vizsgálandó immunglobulin vizsgálatát és BRP humán immunglobulin felhasználásával ACA-negatív és ACA-pozitív kontrollokat készítünk a referenciakészítmény kísérőiratában leírtak szerint. Ha az immunglobulin-koncentráció eltér az 50 mg/ml értéktől, akkor a mintából és a zselatin-barbitál tompítóoldatból kisebb vagy nagyobb mennyiségeket használunk; pl. egy 30 mg/ml koncentrációjú immunglobulin-készítményből 0,33 ml-es részletet veszünk és ehhez 0,47 ml zselatin-barbitál tompítóoldatot adunk, hogy az össztérfogat 0,8 ml legyen. A kémcsöveket lezárjuk és 37 C-on 60 percig inkubáljuk. Ezután az inkubációs keverékek mindegyikéből 0,2 ml-t 9,8 ml zselatin-barbitál tompítóoldathoz elegyítünk, hogy a komplementet felhígítsuk. Az előzőekben leírtak szerint mindegyik kémcső esetében elvégezzük a komplement-titrálást a szabadon maradt komplement-aktivitás meghatározása céljából (lásd a táblázatot). A vizsgált készítmény antikomplement-aktivitását a 100%-osnak tekintett komplement-kontrollhoz képest az alábbi összefüggés segítségével számoljuk ki: a b 100 a a = a komplement-kontroll komplement-aktivitásainak (CH 50 /ml) középértéke, b = a vizsgált minta komplement-aktivitása (CH 50 /ml). A vizsgálat csak abban az esetben értékelhető, ha mind az ACA-negatív, mind az ACA-pozitív kontroll antikomplement-aktivitása a referenciakészítmény kísérőiratában feltüntetett határértékek közé esik, a komplement-kontroll átlagos komplement-aktivitása (a) 80 CH 50 /ml és 120 CH 50 /ml közé esik.