APROTININUM. Aprotinin

Átírás

1 Aprotinin Ph.Hg.VIII. Ph.Eur APROTININUM Aprotinin 01/2009:0580 javított 6.3 C 284 H 432 N 84 O 79 S 7 M R 6511 DEFINÍCIÓ Az aprotinin 58 aminosavból álló polipeptid, mely sztöchiometrikus arányban gátolja számos proteolitikus enzim, mint pl. a kimotripszin, a kallikrein, a plazmin és a tripszin aktivitását. Szárított anyagra vonatkoztatott aprotininaktivitása milligrammonként legalább 3,0 Ph.Eur. Egység. ELŐÁLLÍTÁS Az aprotinin kinyerésére használt állatoknak meg kell felelniük az illetékes hatóság által az emberi fogyasztásra alkalmas állatokkal szemben támasztott egészségügyi követelményeknek. Az előállítási módszert validálni kell annak igazolására, hogy a termék, amennyiben vizsgálnák, megfelelne a következő vizsgálatok követelményeinek. Abnormális toxicitás (2.6.9). A vizsgálandó anyagból minden egérbe R injekcióhoz való vízzel készült, 2 Ph. Eur. E. hatóanyagot tartalmazó, 0,5 ml térfogatú oldatot fecskendezünk. Hisztamin (2.6.10): legfeljebb 0,2 µg hisztamin bázis/3 Ph. Eur. E.

2 Aprotinin Ph.Hg.VIII. Ph.Eur SAJÁTSÁGOK Küllem: csaknem fehér por; nedvszívó. Oldékonyság: vízben, izotóniás oldatokban oldódik, szerves oldószerekben gyakorlatilag nem oldódik. AZONOSÍTÁS A. Vékonyréteg-kromatográfia (2.2.27). Vizsgálati oldat. S oldat (lásd Vizsgálatok). Összehasonlító oldat. BRP aprotinin-oldatot R vízzel olymértékben hígítunk, hogy 15 Ph. Eur. E./ml töménységű oldatot nyerjünk. Lemez: R VRK szilikagél G lemez. Kifejlesztőszer: R víz R tömény ecetsav ( V/V); az elegy 100 g/l R nátrium-acetátot tartalmaz. Felvitel: 10 µl. Kifejlesztés: 12 cm fronttávolságig. Szárítás: levegőn. Előhívás: a lemezt R réz(ii)-klorid 10 g/l töménységű oldata (6 ml), R tömény ecetsav (21 ml) és R vízmentes etanol (70 ml) elegyével amelyben 0,1 g R ninhidrint oldottunk egyenletesen bepermetezzük, majd 60 C-on megszárítjuk. Értékelés: a vizsgálati oldat kromatogramjának főfoltja helyét, színét és méretét tekintve egyezzék meg az összehasonlító oldat kromatogramjának főfoltjával. B. A vizsgálandó készítmény tripszin aktivitást gátló képességét az alábbi eljárással határozzuk meg. Vizsgálati oldat. 1 ml S oldatot R tompítóoldattal (ph 7,2) 50 ml-re hígítunk. Tripszin oldat. 10 mg BRP tripszint 0,002 M sósavval 100 ml-re oldunk. Kazein oldat. 0,2 g R kazeint R tompítóoldattal (ph 7,2) 100 ml-re oldunk. Csapadékképző oldat. R tömény ecetsav R víz R vízmentes etanol ( V/V). 1 ml vizsgálati oldatot 1 ml tripszin oldattal elegyítünk. Az elegyet 10 percig állni hagyjuk, majd 1 ml kazein oldatot adunk hozzá. Az oldatot

3 Aprotinin Ph.Hg.VIII. Ph.Eur ezután 35 C-on 30 percig inkubáljuk. Jeges vízben lehűtve 0,5 ml csapadékképző oldatot adunk hozzá, majd összerázzuk és szobahőmérsékleten 15 percig állni hagyjuk. Az oldat zavaros. Ugyanezen körülmények között üres kísérletet végzünk, a vizsgálati oldat helyett R tompítóoldatot (ph 7,2) használva. Az oldat nem zavaros. VIZSGÁLATOK S oldat. A vizsgálandó anyagból, a címkén deklarált aktivitás alapján, 15 Ph. Eur. E./ml tartalmú oldatot készítünk. Az oldat külleme. Az S oldat tiszta legyen (2.2.1). Abszorbancia (2.2.25): maximum 0,80, a 277 nm-es abszorpciós maximumon mérve. A vizsgálandó anyagból 3,0 Ph. Eur. E./ml tartalmú oldatot készítünk. Dez-Ala-aprotinin és dez-ala-dez-gly-aprotinin. Kapilláris zónaelektroforézis (2.2.47): a normalizációs eljárást alkalmazzuk. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyagból R vízzel legalább 1 Ph. Eur. E/ml töménységű oldatot készítünk. Összehasonlító oldat. BRP aprotinin oldatot R vízzel úgy hígítunk, hogy a vizsgálati oldatéval azonos töménységű oldatot nyerjünk. Kapilláris: anyaga: kvarcüveg, bevonat nélkül; mérete: tényleges hossza = cm, Ø = 75 µm. Hőmérséklet: 25 C. CZE tompítóoldat. 8,21 g R kálium-dihidrogén-foszfátot 400 ml R vízben oldunk, az oldat ph-ját R tömény foszforsavval 3,0 értékre állítjuk be, majd R vízzel 500,0 ml-re hígítjuk, végül (0,45 µm névleges pórusméretű) membránszűrőn szűrjük. Detektálás: spektrofotométerrel, 214 nm-en. Vándoroltatások-közti öblítés: a kapillárist legalább 1 percig olyan 0,1 M nátrium-hidroxiddal öblítjük, amelyet (0,45 µm névleges pórusméretű) membránszűrőn szűrtünk; a kapillárist ezután 2 percig CZE tompítóoldattal öblítjük. Injektálás: nyomás vagy csökkentett nyomás alkalmazásával (pl. 3 másodpercig 3,5 kpa differenciális nyomással).

4 Aprotinin Ph.Hg.VIII. Ph.Eur Vándoroltatás: 0,2 kv/cm térerő alkalmazásával, elektrolitként CZE tompítóoldatot használva mindkét tartályban. Elektroforézis időtartama: 30 perc. Szennyezők azonosítása: az A- és a B-szennyező csúcsát a BRP aprotinin oldathoz mellékelt elektroferogram és az összehasonlító oldat elektroferogramja felhasználásával azonosítjuk. Relatív vándorlás az aprotininre (vándorlási ideje kb 22 perc) vonatkoztatva: A- szennyező kb. 0,98; B-szennyező kb. 0,99. Rendszeralkalmasság: összehasonlító oldat, legalább 6 injektálás után: vándorlási idő: aprotinin: 19,0-25,0 perc; csúcsfelbontás: legalább 0,8, az A- és a B-szennyező között; legalább 0,5, a B-szennyező és az aprotinin között; csúcseloszlás: a kapott elektroferogram kvalitatíve és kvantitatíve egyezzék meg a BRP aprotinin oldathoz mellékelt elektroferogrammal; a főcsúcs magassága: az alapvonal-zaj legalább 1000-szerese. Szükség esetén állítsuk be a minta-terhelést úgy, hogy elegendő magasságú csúcsokat kapjunk. Követelmények: A-szennyező: legfeljebb 8,0%; B-szennyező: legfeljebb 7,5%. Piroglutamil-aprotinin és rokon vegyületek. Folyadékkromatográfia (2.2.29): a normalizációs eljárást alkalmazzuk. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó készítményt az A-mozgófázissal úgy hígítjuk, hogy 5 Ph. Eur. E./ml töménységű oldatot nyerjünk. Összehasonlító oldat. CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt aprotinin egy üvegcséjének tartalmát az A-mozgófázissal úgy oldjuk, hogy a vizsgálati oldatéval azonos töménységű oldatot kapjunk. Oszlop: méretei: l = 0,075 m, Ø = 7,5 mm; állófázis: R kromatográfiás célra szánt erős kationcserélő szilikagél (10 µm); hőmérséklet: 40 C. Mozgófázis:

5 Aprotinin Ph.Hg.VIII. Ph.Eur A-mozgófázis: 3,52 g R kálium-dihidrogén-foszfátot és 7,26 g R dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrátot 1000 ml vízben oldunk; az oldatot szűrjük és gázmentesítjük; B-mozgófázis: 3,52 g R kálium-dihidrogén-foszfátot, 7,26 g R dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrátot és 66,07 g R ammónum-szulfátot 1000 ml vízben oldunk; az oldatot szűrjük és gázmentesítjük; Idő (perc) A-mozgófázis (%V/V) B-mozgófázis (%V/V) Áramlási sebesség: 1,0 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 210 nm-en. Injektálás: 40 µl. Relatív retenció az aprotininre (retenciós ideje = 17,0 20,0 perc) vonatkoztatva: C-szennyező kb. 0,9. Rendszeralkalmasság: összehasonlító oldat: csúcsfelbontás: legalább 1,5, a C-szennyező és az aprotinin között; szimmetriafaktor: legfeljebb 1,3, az aprotinin csúcsára vonatkozóan. Követelmények: C-szennyező: legfeljebb 1,0%; egyéb szennyezők egyenként: legfeljebb 0,5%, összes szennyező a C-szennyező kivételével: legfeljebb 1,0%. Aprotinin oligomerek. Méretkizárásos kromatográfia (2.2.30): a normalizációs eljárást alkalmazzuk. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó készítményt R vízzel úgy hígítjuk, hogy kb. 5 Ph. Eur. E./ml töménységű oldatot kapjunk. Összehasonlító oldat: A vizsgálandó anyagot olyan kezelésnek vetjük alá, hogy az anyag kb. 2% aprotinin oligomert tartalmazzon. Például a fagyasztva szárított aprotinint kb. 4 órán át kb. 110 C-on hevítjük. Az így kezelt anyagból ezután R vízzel kb. 5 Ph. Eur. E./ml töménységű oldatot készítünk. Oszlop: méretei: l = 0,30 m, Ø = 7,8 mm;

6 Aprotinin Ph.Hg.VIII. Ph.Eur állófázis: a től ig terjedő relatív molekulatömegtartományba eső globuláris fehérjék frakcionálására alkalmas R kromatográfiás célra szánt hidrofil szilikagél (µm). Mozgófázis: R acetonitril R tömény ecetsav R víz (2+2+6 V/V); az elegyet szűrjük és gázmentesíjük. Áramlási sebesség: 1,0 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 277 nm-en. Injektálás: 100 µl. Kromatografálási idő: 40 perc. Relatív retenció az aprotinin monomerre (retenciós ideje 24,5-25,5 perc) vonatkoztatva: aprotinin dimer kb. 0,9. Rendszeralkalmasság: összehasonlító oldat: csúcsfelbontás: legalább 1,3, az aprotinin dimer és monomer között; szimmetriafaktor: legfeljebb 2,5, az aprotinin monomer csúcsára vonatkozóan. Követelmény: szennyezők összesen: legfeljebb 1,0%. Szárítási veszteség (2.2.32): legfeljebb 6%. Az anyag 0,100 g-ját csökkentett nyomáson szárítjuk. Bakteriális endotoxinok (2.6.14): kevesebb, mint 0,14 NE/Ph. Eur. E. aprotinin. A parenterális gyógyszerkészítmények előállítására szánt anyag abban az esetben, ha a belőle előállított készítmény gyártása során nem alkalmaznak a bakteriális endotoxinok eltávolítására alkalmas eljárást feleljen meg e vizsgálat követelményeinek is. TARTALMI MEGHATÁROZÁS Az aprotinin aktivitását ismert aktivitású tripszin oldatra kifejtett gátló hatása alapján határozzuk meg. Az aprotinin gátló hatását a tripszin kiindulási és maradék aktivitása közötti különbségből számítjuk ki. Az aprotinin gátló hatását Európai Gyógyszerkönyvi Egységekben fejezzük ki. 1 Ph. Eur. E. 2 mikrokatal aktivitásnak megfelelő tripszint 50%-ban gátol. A vizsgálathoz egy kb. 30 ml-es reakcióedényt használunk, a következőkkel felszerelve: a hőmérsékletet 25 ± 0,1 C-on tartó egység;

7 Aprotinin Ph.Hg.VIII. Ph.Eur keverőegység, például mágneses keverő; 5 lyukkal ellátott fedő; a lyukakba illeszkednek az elektródok, egy büretta kifolyónyílása, egy nitrogénbevezető cső; az ötödik nyílás a reagensek bejuttatására szolgál. Automata vagy kézi működtetésű titráló berendezést használhatunk. Az utóbbi esetben a bürettának 0,05 ml-es beosztása legyen; a ph-mérő széles skálával rendelkezzék, és üveg- és kalomel vagy üveg-ezüst-ezüst-klorid elektródok tartozzanak hozzá. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyagból R 0,0015 M borát tompítóoldattal (ph 8,0) 1,67 Ph. Eur. E./ml becsült aktivitású (kb. 0,6 mg (m mg)/ml) oldatot készítünk. Tripszin oldat. BRP tripszinből 0,001 M sósavval kb. 0,8 mikrokatal/ml aktivitású (kb. 1 mg/ml töménységű) oldatot készítünk. Frissen készített oldatot használunk; az oldatot jeges vízben tartjuk. Tripszin és aprotinin oldat. A tripszin oldat 4,0 ml-éhez 1,0 ml vizsgálati oldatot elegyítünk. Az elegyet R 0,0015 M borát tompítóoldattal (ph 8,0) azonnal 40,0 ml-re hígítjuk. Az oldatot 10 percig szobahőmérsékleten hagyjuk állni, majd jeges vízben tartjuk. Az elkészítés után 6 órán belül felhasználjuk. Hígított tripszin oldat. A tripszin oldatot 0,5 ml-ét R 0,0015 M borát tompítóoldattal (ph 8,0) 10,0 ml-re hígítjuk. A hígított oldatot 10 percig szobahőmérsékleten hagyjuk állni, majd jeges vízben tartjuk. A reakcióedényben nitrogénatmoszférát alkalmazunk, és folyamatos kevertetést végzünk. 9,0 ml R 0,0015 M borát tompítóoldatot (ph 8,0) és R benzoilarginin-etil-észter-hidroklorid frissen készült, 6,9 g/l töménységű oldatának 1,0 ml-ét mérjük az edénybe. Az oldat ph-ját 0,1 M nátriumhidroxid oldattal 8,0-re állítjuk be. Amint a hőmérséklet kiegyenlítődik és beáll 25 ± 0,1 C-ra, 1,0 ml tripszin és aprotinin oldatot adunk az oldathoz, és elindítunk egy stopperórát. Az oldat ph-ját 0,1 M nátrium-hidroxid oldat adagolásával 8,0 értéken tartjuk és a hozzáadott térfogatot minden 30 másodpercben feljegyezzük. A reakciót 6 percen át folytatjuk, és meghatározzuk a 0,1 M nátrium-hidroxid oldat másodpercenként felhasznált ml-einek számát (n 1 ml). Ugyanezen körülmények között 1,0 ml hígított tripszin oldat titrálását is elvégezzük. Meghatározzuk a 0,1 M nátrium-hidroxid oldat másodpercenként fogyott ml-einek számát (n 2 ml). Az Európai Gyógyszerkönyvi Egység/ml-ben kifejezett aprotinin-aktivitást a következő kifejezés alapján számítjuk ki: 4000(2n 2 n1 ) m A mért aktivitás a feliraton deklarált aktivitás %-a legyen.

8 Aprotinin Ph.Hg.VIII. Ph.Eur ELTARTÁS Légmentesen záró, garanciazáras edényben, fénytől védve. FELIRAT A feliraton fel kell tüntetni: az Európai Gyógyszerkönyvi Egység/mg-ban kifejezett aprotininaktivitást; adott esetben, hogy az anyag alkalmas parenterális készítmények előállítására. SZENNYEZŐK A. Ra = H, Rb = OH: aprotinin-(1-56)-peptid, B. Ra = H, Rb = Gly-OH: aprotinin-(1-57)-peptid, C. Ra = Glp, Rb = Gly-Ala-OH: (5-oxoprolil)aprotinin (piroglutamilaprotinin).