INSULINUM PORCINUM. Sertés inzulin

Átírás

1 Insulinum porcinum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur INSULINUM PORCINUM Sertés inzulin 01/2008:1638 javított 8.6 C 256H 381N 65O 76S 6 M r 5778 DEFINÍCIÓ A sertés inzulin sertés hasnyálmirigyből kivont, tisztított, természetes antidiabetikus hatású fehérje. Tartalom: sertés inzulin (C 256H 381N 65O 76S 6) és A21 dezamido sertés inzulin összesen: 95,0 105,0% (szárított anyagra). Az inzulin készítmények feliratozásához az átszámítási arány megállapodás szerint a következő: 0,0345 mg sertés inzulin 1 NE inzulinnak felel meg. ELŐÁLLÍTÁS A sertés inzulin kinyeréséhez használt állatoknak meg kell felelniük az emberi fogyasztásra alkalmas állatokkal szemben támasztott egészségügyi követelményeknek. SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér, vagy csaknem fehér por. Oldékonyság: vízben és etanolban gyakorlatilag nem oldódik. Híg ásványi savakban oldódik; híg alkálilúgokban bomlás közben oldódik. AZONOSÍTÁS A. A Tartalmi meghatározás pontban nyert kromatogramokat vizsgáljuk. Értékelés: a vizsgálati oldat kromatogramján látható főcsúcs retenciós idejét tekintve feleljen meg a b) összehasonlító oldat kromatogramján megjelenő főcsúcs retenciós idejének.

2 Insulinum porcinum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur B. Peptidtérkép-vizsgálat. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyagból 0,01 M sósavval, 2,0 mg/ml töménységű oldatot készítünk és az oldat 500 µl-ét egy tiszta kémcsőbe mérjük. Hozzáadunk 2,0 ml R HEPES tompítóoldatot (ph 7,5), valamint R Staphylococcus aureus (V8 törzs) proteáz 1 mg/ml töménységű oldatának 400 µlét. A csövet lezárjuk és 6 órán át 25 C-on inkubáljuk. A reakciót 2,9 ml R szulfát tompítóoldat (ph 2,0) hozzáadásával állítjuk le. Összehasonlító oldat. A vizsgálati oldattal egyidejűleg és azonos módon készítjük, de a vizsgálandó anyag helyett CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt sertés inzulint használunk. A hidrolizátumokat folyadékkromatográfiával vizsgáljuk (2.2.29). méretei: l = 0,10 m, Ø = 4,6 mm, állófázis: R kromatográfiás célra szánt octadecilszililezett szilikagél (3 µm), hőmérsékelet: 40 C. Mozgófázis: A-mozgófázis: 100 ml R kromatográfiás célra szánt acetonitrilt, 700 ml R vizet és 200 ml R szulfát-tompítóoldatot (ph 2,0) elegyítünk; az elegyet szűrjük és gázmentesítjük, B-mozgófázis: 400 ml R kromatográfiás célra szánt acetonitrilt, 400 ml R vizet és 200 ml R szulfát-tompítóoldatot (ph 2,0) elegyítünk; az elegyet szűrjük és gázmentesítjük, Idő (perc) A-mozgófázis B-mozgófázis Áramlási sebesség: 1 ml/min. Detektálás: spektrofotométerrel, 214 nm-en. Egyensúly beállítása: a kezdeti körülményekkel legalább 15 percig. A fentebb említett gradienssel üres kromatografálást is végzünk. Injektálás: 50 µl. Rendszeralkalmasság: a vizsgálati oldat és az összehasonlító oldat kromatogramja hasonló legyen a CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt sertés inzulinhoz mellékelt sertés inzulin-hidrolizátum kromatogramhoz. Az összehasonlító oldat kromatogramján azonosítjuk az I., II. és III. hidrolizátumfragmenst. A II. és III. fragmens csúcsára vonatkozó szimmetria faktor legfeljebb 1,5, és a két csúcs közti csúcsfelbontás legalább 1,9 legyen. Értékelés: a vizsgálati oldat kromatogramjának profilja feleljen meg az összehasonlító oldattal kapott kromatogram profiljának. MEGJEGYZÉS: az I. fragmens retenciós ideje sertés inzulin és humán inzulin esetén azonos. A II. és IV. fragmens retenciós ideje minden inzulinra azonos. A III. fragmens retenciós ideje szarvasmarha inzulin és sertés inzulin esetén azonos. VIZSGÁLATOK

3 Insulinum porcinum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur Az inzulinnál nagyobb molekulatömegű szennyezők. Méretkizárásos kromatográfia (2.2.30): a normalizációs eljárást használjuk. Az oldatot 2 10 C-on tároljuk, és 7 napon belül felhasználjuk. Ha automata mintaadagolót használunk, annak hőmérsékletét is 2 10 C-on tartjuk. Vizsgálati oldat. 4 mg vizsgálandó anyagot 1,0 ml 0,01 M sósavban oldunk. Csúcsfelbontás-ellenőrző oldat. Több mint 0,4% nagy molekulatömegű fehérjét tartalmazó inzulin oldatát (kb. 4 mg/ml) használjuk. A vizsgálathoz használhatunk a jelzett százalékban nagy molekulatömegű fehérjét tartalmazó oldat vagy szuszpenzió formájú injektálható inzulin készítményt, amelyből 6 M sósavval tiszta oldatot készítünk, illetve használhatunk 0,01 M sósavban feloldott por alakú inzulint. A kívánt nagy molekulatömegű fehérje arány elérhető, ha por alakú inzulint kb. 10 napig szobahőmérsékleten tárolunk. méretei: l = 0,3 m, Ø: legalább 7,5 mm, állófázis: R kromatográfiás célra szánt hidrofil szilikagél (5 10 µm), amely alkalmas az inzulin monomer dimertől és polimerektől való elválasztására. Mozgófázis: R tömény ecetsav (15 térfogatrész), R acetonitril (20 térfogatrész) és R arginin 1 g/l töménységű oldatának (65 térfogatrész) elegye; az elegyet szűrjük és gázmentesítjük. Áramlási sebesség: 0,5 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 276 nm-en. Egyensúly beállítása. Mielőtt egy új kromatográfiás oszlopot kezdünk használni, nagy molekulatömegű fehérjéket tartalmazó inzulin oldat ismételt injektálásával beállítjuk az oszlop egyensúlyát. Ezt megtehetjük a csúcsfelbontás-ellenőrző oldat legalább háromszori injektálásával. Az oszlop akkor tekinthető egyensúlyban lévőnek, ha két egymás utáni injektálással ugyanolyan eredményt kapunk. Injektálás: 100 µl. Kromatografálási idő: kb. 35 perc. Retenciós idők: polimer inzulin komplexek: perc; kovalens dimer inzulin: kb. 17,5 perc; inzulin monomer: kb. 20 perc; sók: kb. 22 perc. Rendszeralkalmasság: csúcsfelbontás-ellenőrző oldat: hegy-völgy arány: legalább 2,0, ahol H p = a dimercsúcs alapvonaltól számított magassága, H v = a dimercsúcsot a monomercsúcstól elválasztó görbeszakasz minimumának alapvonaltól mért távolsága. Követelmények: a főcsúcsnál kisebb retenciós idejű csúcsok területének összege nem lehet nagyobb, mint az összes csúcsok területösszegének 1,0%-a. Az inzulin csúcsnál nagyobb retenciós idejű csúcsokat nem vesszük figyelembe. Rokon fehérjék. Folyadékkromatográfia (2.2.29), a Tartalmi meghatározás pontban leírtak szerint, az alábbi táblázatban található elúciós körülmények között: Idő (perc) A-mozgófázis (%)V/V B-mozgófázis Az oldatokat 2 10 C-on tartjuk és 24 órán belül felhasználjuk.

4 Insulinum porcinum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur Az elválasztó rendszer alkalmasságát (csúcsfelbontás, linearitás) a Tartalmi meghatározás részben leírtak szerint vizsgáljuk. Szükség esetén változtathatunk a mozgófázis összetételén, hogy az A21 dezamido sertés inzulin még a grádiens indítása előtt teljes mértékben eluálódjon. A grádiens profilján is változtathatunk, hogy az inzulinnal rokon szennyezők teljes elúciója megtörténjen. 20 µl b) összehasonlító oldatot és 20 µl vizsgálati oldatot injektálunk. A Tartalmi meghatározás részben leírt linearitás vizsgálat eredménye alapján az injektált anyag mennyiségét szükség esetén 10 µl és 20 µl között változtathatjuk. A kromatogramokat kb. 50 percig rögzítjük. A b) összehasonlító oldat kromatogramján az A21 dezamido sertés inzulin kis csúcsként jelenik meg a főcsúcs után, kb. 1,3 relatív retencióval a főcsúcshoz képest. A vizsgálati oldat kromatogramján az A21 dezamido sertés inzulin csúcs alatti területe a csúcsok összterületének legfeljebb 2,0%-a lehet; a sertés inzulin és az A21 dezamido sertés inzulin csúcsán kívül megjelenő többi csúcs területének összege nem lehet nagyobb, mint a csúcsok összterületének 2,0%-a. Sertés proinzulin-szerű immunreaktivitás (porcine proinsulin-like immunoreactivity PLI): legfeljebb 10 ppm (szárított anyagra). A meghatározáshoz kellően érzékeny immunkémiai módszert (2.7.1), pl. radioimmun meghatározást használunk. A módszer kalibrálásához a sertés proinzulin Nemzetközi Referencia Reagenst használjuk. Cink: legfeljebb 1,0% (szárított anyagra). Atomabszorpciós spektrometria (2.2.23, I. módszer). Vizsgálati oldat. 50,0 mg vizsgálandó anyagot 0,01 M sósavval 25,0 ml-re oldunk. Szükség esetén az oldatot 0,01 M sósavval tovább hígítjuk, hogy a cink koncentráció a megfelelő tartományba (0,4 1,6 µg/ml) essék. Összehasonlító oldatok. 0,40 µg/ml, 0,80 µg/ml, 1,00 µg/ml, 1,20 µg/ml és 1,60 µg/ml Zn-tartalmú oldatokat használunk, amelyeket R cink mértékoldat (5 mg/ml Zn) 0,01 M sósavval történő hígításával frissen állítunk elő. Fényforrás: cink vájtkatód lámpa. Hullámhossz: 213,9 nm. Láng: megfelelő összetételű levegő-acetilén láng (pl. 11 liter levegő és 2 liter acetilén percenként). Szárítási veszteség (2.2.32): legfeljebb 10,0%. 0,200 g anyagot szárítószekrényben 105 C-on 24 órán keresztül szárítunk. Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 2,5% (szárított anyagra). 0,200 g anyagot vizsgálunk. Bakteriális endotoxinok (2.6.14): kevesebb, mint 10 NE/mg. A parenterális gyógyszerkészítmény előállítására szánt anyag amennyiben nem alkalmaznak a bakteriális endotoxinok eltávolítására alkalmas eljárást feleljen meg e vizsgálat követelményének is. TARTALMI MEGHATÁROZÁS Folyadékkromatográfia (2.2.29). Vizsgálati oldat. 40,0 mg vizsgálandó anyagot 0,01 M sósavval 10,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (a). CRS humán inzulin 1 injekciós üvegének tartalmát annyi 0,01 M sósavban oldjuk, hogy 4,0 mg/ml töménységű oldatot kapjunk. Összehasonlító oldat (b). CRS sertés inzulin 1 injekciós üvegének tartalmát annyi 0,01 M sósavban oldjuk, hogy 4,0 mg/ml töménységű oldatot kapjunk. Összehasonlító oldat (c). 1,0 ml b) összehasonlító oldatot 0,01 M sósavval 10,0 ml-re hígítunk.

5 Insulinum porcinum Ph.Hg.VIII. Ph.Eur Csúcsfelbontás-ellenőrző oldat. 1,0 ml a) összehasonlító oldatot 1,0 ml b) összehasonlító oldattal elegyítünk. Az oldatokat 2 10 C-on tároljuk és 48 órán belül felhasználjuk. Ha automata mintaadagolót használunk, annak hőmérsékletét is 2 10 C-on tartjuk. méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm. állófázis: R kromatográfiás célra szánt, oktadecilszililezett szilikagél (5 µm), hőmérséklet: 40 C. Mozgófázis: 42 térfogatrész A-mozgófázist és 58 térfogatrész B-mozgófázist elegyítünk; szükség esetén módosítjuk az elegy összetételét. A következő oldatokat legalább 20 C-on készítjük és tartjuk: A-mozgófázis: 28,4 g R vízmentes nátrium-szulfátot R vízzel 1000 ml-re oldunk, majd hozzáadunk 2,7 ml R tömény foszforsavat, és ha szükséges az oldat ph-ját R etanolaminnal 2,3-re állítjuk be. Az oldatot szűrjük és gázmentesítjük; B-mozgófázis: 550 ml A-mozgófázist és 450 ml R acetonitrilt elegyítünk. A csapadékképződés elkerülésére az oldatot legalább 20 C-ra melegítjük (az A-mozgófázis acetonitrillel történő elegyítése endoterm folyamat). Az oldatot szűrjük és gázmentesítjük. Áramlási sebesség: 1 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 214 nm-en. Rendszeralkalmasság: csúcsfelbontás: 20 µl csúcsfelbontás-ellenőrző oldatot és 20 µl b) összehasonlító oldatot injektálunk. A csúcsfelbontás-ellenőrző oldat kromatogramját addig rögzítjük, amíg a b) összehasonlító oldat főcsúcsának megfelelő csúcs tisztán látható. A csúcsfelbontás-ellenőrző oldat kromatogramján azonosítjuk a sertés inzulin és humán inzulin csúcsát. A vizsgálat csak abban az esetben értékelhető, ha a sertés inzulin és humán inzulin közti csúcsfelbontás legalább 1,2. A megfelelő csúcsfelbontás elérése érdekében szükség esetén módosítjuk a mozgófázis acetonitril-tartalmát. linearitás: az oszlopra 20 µl b) összehasonlító oldatot és 20 µl c) összehasonlító oldatot injektálunk. A vizsgálat csak abban az esetben értékelhető, ha a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe 10 ± 0,5-szer nagyobb, mint a c) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe. Amennyiben az arány más, akkor az injektált térfogatot 10 µl és 20 µl között változtathatjuk, hogy a jel a detektor lineáris tartományába essék. Injektálás: 20 µl vizsgálati oldat. Az anyag együttes sertés inzulin (C 256H 381N 65O 76S 6) és A21 dezamido sertés inzulin tartalmát a vizsgálati oldat és a b) összehasonlító oldat kromatogramján megjelenő főcsúcs területe és az A21 dezamido sertés inzulinnak megfelelő csúcs területe, továbbá a CRS sertés inzulin deklarált együttes sertés inzulin és A21 dezamido sertés inzulin tartalma alapján számítjuk ki. ELTARTÁS A gyártó által végzett felszabadításig légmentesen zárt tartályban, fénytől védve, 20 C-on. Felengedés után az inzulin a készítmények előállítását megelőzően rövid ideig 5 ± 3 C-on tárolható. A levegő páratartalmának abszorpcióját elkerülendő, a tömegmérést mindig szobahőmérsékletre melegített inzulinnal kell végezni.