Immunológiai Gyakorlatok II április

Átírás

1 Immunológiai Gyakorlatok II április T- és B-limfociták szeparálása (dúsítása) egér lépsejt-szuszpenzióból; neutrofil extracelluláris csapda (NET) vizsgálata Anyagok: steril fülke, olló, csipesz, fecskendő, petri csésze, Falcon cső, szűrő (mind steril), centrifuga, pipetta, Bürker kamra GKN (fiziológiás NaCl, glukóz és fenolvörös tartalmú foszfát puffer, ph 7.2) RPMI 1640 komplett médium (2-merkapto-etanollal, piruváttal és antibiotikumokkal kiegészített, 10 % FCS-t tartalmazó tápoldat) ACK (KCl és EDTA tartalmú 0,83 %-os ammóniumklorid oldat) Anti-Thy-1.2 (HO-13.4 egér monoklonális IgM) tartalmú sejttenyészet felülúszó Friss (legfeljebb egyszer lefagyasztott és felolvasztott) nyúlsavó Tripánkék (festék sejtszámoláshoz, élő/pusztult arány megállapításához) A lép feldolgozása: 1. A lép és a combcsontok steril körülmények között történő kivétele az egerekből GKN oldatot tartalmazó petricsészékbe. A csontvelő izolálása a D. pontban! 2. Sejtszuszpenzió készítése és 50 ml-es Falcon csövekbe töltése majd a sejtek lecentrifugálása (7 perc, 1200 rpm, 4 C) 3. A felülúszó leöntése után a sejtüledék fellazítása (vortex), majd ml ACK oldat hozzáadásával a vörösvérsejtek lízise. 1,5 perc inkubálás után a csövek feltöltése GKN-nel (50 ml), majd a sejtek lecentrifugálása (7 perc, 1200 rpm, 4 C). 4. A sejtek felvétele 10 ml RPMI-ben, átszűrése (70µm-es sejtszűrő), majd a sejtszám megállapítása Bürker-kamrával. 5. A sejtszuszpenzió kettéosztása: 7 ml szuszpenzió a T-sejt deplécióhoz, 3 ml a sejtszortírozáshoz. A. B-limfociták dúsítása T-sejt deplécióval A/6. A 7 ml lépsejtszuszpenzió kiegészítése 1 ml anti-thy-1 tartalmú sejttenyészet felülúszóval és 2 ml tápoldattal, majd 20 perc inkubálás szobahőmérsékleten. A/7. A sejteket lecentrifugálása (7 perc, 1200 rpm, 20 C) után a felülúszó elöntése és a sejtüledék fellazítása, majd a sejtek felvétele 9 ml GKN oldatban. 1 ml friss nyúlsavó (komplement forrás) hozzáadása, majd inkubálás percig 37 C-os vízfürdőben. A/8. A sejtek lecentrifugálása (7 perc, 1200 rpm, 20 C), mosása 50ml GKN oldatban (centrifugálás: 7 perc, 1200 rpm, 20 C) majd a sejtek felvétele 5 ml tápoldatban, sejtszámolás. 1

2 B. T-sejt dúsítás szorterrel és a T-sejt depléció ellenőrzése áramlási citometriával Hozzávalók: - teljes lépsejt szuszpenzió és T-sejt depletált lépsejt szuszpenzió - FACS puffer (PBS, 1% FCS, 0,1% Na-azid) - FACS csövek - előre kihígított FcγR blokkoló ellenanyag 50 ul / cső - előre kihígított konjugált ellenanyagok (ea): anti-cd3-fitc 50 μl / cső anti-cd19-apc 50 μl / cső A módszer leírása: A T-sejt-depletált szuszpenzió egy részét (~10 6 sejtet) és a teljes szuszpenziót is lecentrifugáljuk (7 perc,1200 rpm, 4 C), majd leöntjük róluk a médiumot. Enyhe vortexelés után µl FcγR blokkoló ellenanyagot pipettázunk a sejtpelletekre (5 perc inkubáció jégen). Ezek után felvesszük a sejteket 1-1 ml FACS pufferben, és szétosztjuk őket FACS csövekbe 250µl-enként. Minden csőhöz a táblázat alapján hozzáadjuk a megfelelő antitesteket (50 µl / cső). 20 perc inkubáció, fénytől elzárva, 4 C. cső minta Antitestek (20 perc jégen) 1. teljes lép - 2. teljes lép anti-cd19-apc 3. teljes lép anti-cd3-fitc 4. teljes lép anti-cd19-apc + anti-cd3-fitc 5. T-sejt depletált - 6. T-sejt depletált anti-cd19-apc 7. T-sejt depletált anti-cd3-fitc 8. T-sejt depletált anti-cd19-apc + anti-cd3-fitc Mosás 3ml FACS pufferrel, a mosási lépést követően a fellazított sejtpellethez 500 μl FACS puffert adunk. A sejtek lemérése FACS ARIA III. sejtszortírozó berendezéssel. Feladat: Határozzuk meg a B-sejt dúsítás hatékonyságát az egyes mintákban a B- és T-sejtek %-os arányának megállapításával! C. Proliferációs teszt CFSE jelöléssel Hozzávalók: T-sejt depletált lépsejtek CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester) 10 mm-os oldata PBS-5 %FCS stimuláló ellenanyag: kecskében termelt anti-egér IgM (0,5 mg/ml) A sejtek feltöltése CFSE-vel: A T-sejt deplécióval tisztított B-sejtek koncentrációját 2-5x10 7 /ml-re állítsuk be 1 ml végtérfogatban, PBS/5%FCS oldatban, 15 ml-es Falcon csőben. Adjunk a sejtekhez 5 µm 2

3 végkoncentrációban CFSE-t, majd inkubáljuk sötétben, szobahőmérsékleten 10 percig. Mossuk a sejteket 2x PBS-5%FCS oldattal (10 ml, 7 perc,1200 rpm, 20 C) majd vegyük fel a sejteket tápfolyadékban és állítsuk be a sejtszámot 2x10 6 /ml-re. A sejtek stimulálása: Tegyük ki a sejteket 96 lyukú platre ( µl sejtszuszpenzió/lyuk, mintánként 3 párhuzamos), adjuk hozzá a stimuláló ellenanyagot (anti-igm) 100 ul-ben, 10 és 1 µg/ml végkoncentrációban, majd 5 napra, 37 C-ra, CO2 termosztátba helyezzük a sejteket. A sejtproliferációt FACS segítségével, 5 nap elteltével mérjük. A B tápoldat tápoldat tápoldat C a-igm 1 a-igm 1 a-igm 1 D a-igm 10 a-igm 10 a-igm 10 E F G H D. Neutrofil granulociták kinyerése és stimulálása A combcsontokat kiszedjük az egerekből, majd Petri-csészében GKN-oldattal injekciós tű segítségével kimossuk a csontvelőt a combcsontokból. A szuszpenziót lecentrifugáljuk (7 perc,1200 rpm, 4 C), a vörösvértesteket a lépnél leírtak szerint ACK oldattal lizáljuk, majd mosás után a sejteket 1ml tápoldatban felvesszük. 8-lyukú kamrás lemezen két lyukba 5x10 5 sejtet mérünk, és 20 percig hagyjuk őket kitapadni (37 C, CO2 inkubátor). A tápoldatot óvatosan leszívjuk, majd a kontrollhoz 150 µl tápoldatot, a stimulált mintához 150 µl 100 nm phorpbol-miristoyl-acetátot (PMA; protein kináz C aktivátor) tartalmazó tápoldatot pipettázunk. A kamrát 3 órára 37 C-os CO2 inkubátorba rakjuk. Festés: A lyukakból kiszívjuk a folyadékot, majd PBS-sel óvatosan 2x mossuk. Lyukanként 120 µl Sytox orange festéket tartalmazó oldatot pipettázunk, 20 percig állni hagyjuk a mintákat, majd CLSM-mel értékeljük. 3

4 A B-sejtek antigénreceptor-közvetített aktivációja: Intracelluláris fehérjék foszforilációjának kimutatása Western blot módszerrel Anyagok, pufferek, reagensek, eszközök: BL41 sejtvonal (humán, érett B sejtek) aktiváló ellenanyag (anti-humán IgG+M F(ab )2 ), előzetesen titrálva szérummentes RPMI 1640 médium lízis puffer (a sejtek szolubilizálására alkalmas, detergens tartalmú oldat): Tris 50mM, NaCl 150mM, EDTA 5mM, 0,1% NP40, ph 7,6 A pufferhez mindig frissen adjuk a proteáz- és foszfatázgátlókat: Proteázinhibitor koktél hígítás: 1:20 Foszfatázinhibitor koktél hígítás: 1:50 folyékony nitrogén Gélöntéshez: akrilamid-biszakrilamid 33 %-os oldata. 0,5 M-os Tris/HCl puffer ph 6.8 1,5 M-os Tris/HCl puffer ph %-os SDS oldat 10%-os ammónium perszulfát oldat (APS) N,N,N',N'-tetrametil-etiléndiamin (TEMED) 2-szeres redukáló minta-puffer a poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE)-hez: (0.5 M Tris/HCl ph 6.8, SDS, glicerin, 2-merkapto-etanol, brómfenolkék) Elektroforézis futtató puffer: (14.4 g/l glicin, 3 g/l Tris/HCl, 0.1 % SDS ph: 8,3) Blottoló puffer: (14.4 g/l glicin, 3 g/l Tris/HCl ph: 8,3) Membrán-mosó puffer (TWB): 1 literre (ph: 7.6): 2.42 g/l Tris (20 mm) 8.00 g/l NaCl (137 mm) 3.8 ml 1 M HCl 0.05 % TWEEN - Blokkoló puffer: 5% BSA oldat TWB-ben - szűrőpapír, nitrocellulóz membrán (0.45 µm pórusméret) a blottoláshoz - Eppendorf-csövek, pipetták, centrifugacsövek, automata pipetták - molekula-tömeg standard - anti-foszfotirozin monoklonális ellenanyag - anti-egér IgG-tormaperoxidázzal konjugálva - kemiluminescens szubsztrát (ECL-reagens) - röntgen film - előhívó és fixáló oldatok - elektroforézis és blottoló készülék 4

5 A sejtek aktiválása: - Mossuk a B-sejteket szérum-mentes médiumban, és állítsuk a sejtek számát 1x10 7 /ml-re. - Tartsuk a mintákat (200 µl/ Eppendorf-cső) szérum-mentes médiumban 37 C-on percig, majd aktiváljuk a sejteket 2, 5, 20 és 60 percig 5 µg anti-humán IgG+M-el + készítsünk egy 60 perces aktivált mintát, amit foszfatázinhibitor mentes lízis pufferben fogunk lizálni. (A reakció pontos leállítása érdekében az egyes mintákat az idő visszaszámlálásával stimuláljuk, vagyis a 2-perces aktivációt az 58. percben kezdjük el.) - Centrifugáljuk a mintákat rögtön az inkubációs idő elteltével (14000 g, 30 mp), szívjuk le a felülúszót és tegyük a sejtüledéket tartalmazó Eppendorf-csövet lezárva folyékony nitrogénbe. Így az adott időpontban a sejtekre jellemző aktivitást befagyasztjuk. Minták: - Kontroll (nem aktivált) foszfatáz-gátló mentes lízis pufferrel A sejtek szolubilizálása - Vegyük ki a csöveket a nitrogénből csipesszel és minden mintához azonnal mérjünk 100 µl szolubilizáló puffert. Vortex segítségével azonnal keverjük össze, amíg nem marad üledék a cső alján. - Hagyjuk állni a mintákat jég között 30 percig. - A detergensben oldhatatlan frakciót (törmelék membrán, mag, stb.) ülepítsük g-vel 15 percig centrifugálva 4 oc-on. - Vigyünk át 90 µl felülúszót újabb Eppendorf-csövekbe és mérjünk hozzá 90 µl 2X redukáló mintapuffert. SDS-PAGE és Western blot - Futtassunk meg SDS-PAGE-sel minden mintából 20 µl-t, redukáló közegben. - Blottoljuk a szétválasztott fehérje-elegyet nitrocellulóz membránra. - Blokkoljuk a sejtlizátum fehérjéit tartalmazó nitrocellulóz membrán szabadon maradt kötőhelyeit szobahőmérsékleten 5 % BSA-t tartalmazó TWB-vel 1 órán át billegőasztalon. - Adjunk egy újabb adag 5% BSA-t tartalmazó TWB-hez monoklonális anti-foszfotirozin ellenanyagot (1:8000 hígításban) és inkubáljuk 4 C-on éjszaka, állandó mozgatással, billegő asztalon. Fontos, hogy a teljes membránt fedje az ellenanyag tartalmú oldat. (ált ml térfogat szükséges.) - Másnap mossuk a nitrocellulóz membránt 3 x 10 percig TWB Tween pufferrel. - Adjuk a nitrocellulóz membránhoz az anti-egér IgG F(ab )2-HRPO konjugátumot 3% BSA tartalmú pufferben, 8000-szeres hígításban és inkubáljuk 1 órán át szobahőmérsékleten, állandó mozgatás közben. - Mossuk a nitrocellulóz membránt 5-6x 5 percig TWB-Tween pufferrel, majd kemilumineszcencia (ECL) reagens alkalmazásával detektáljuk a tirozinon foszforilált fehérjéket. Az ECL mindkét komponenséből 1-1 ml-t keverünk össze, majd a blottot kissé leitatva, 1 percig állandóan mozgatva tartjuk a reagensben. 5

6 - 1 perc elteltével a reagens leöntése és leitatása utána a membránt helyezzük röntgenkazettába, fóliák közé, sötétkamrában tegyünk rá filmet, és 30 sec -5 perc közötti időtartamig való expozíció után hívjuk elő a filmet. Feladat: Értékeljük az előhívott Western-blotot a tirozin foszforiláció intenzitása (denzitás) szempontjából az aktiváció körülményei és az idő függvényében! 6

7 A B limfocita aktiváció jellemzői II.: a B sejt receptor internalizációja A B sejtek B sejt receptoron (BCR) keresztüli aktivációjakor hasonlóan a T sejtek TCR-en keresztüli aktivációjához - két fontos folyamat indul be. Az egyik a gyakorlaton is vizsgált foszforilációs kaszkád, a másik pedig a receptor-antigén komplex internalizálódása (más néven receptor-közvetített endocitózis), vagyis a citoplazmába kerülése. Ez utóbbi folyamat eredményeképpen megy végbe az antigén processzálása, majd az antigénből származó peptidek MHCII-molekulákon keresztüli újraprezentálása a T-sejtek felé. Az endocitózis kezdeti szakaszának vizsgálatát a gyakorlaton áramlási citofluoriméterrel végezzük. A kísérletben a BCR-aktivációt követően a sejtfelszíni BCR-molekulák mennyiségét detektáljuk, és a kapott adatokból következtetünk az idő folyamán eltűnő, azaz internalizálódott BCR-molekulák mennyiségére. A gyakorlat menete: Mintánként 5x10 5 RAMOS sejtet 500 μl szérummentes médiumban veszünk fel, FACScsövekbe rakjuk, percig inkubátorban tartjuk 37 C-on, majd 2-3 percig jégre helyezzük. Ezután anti-humán IgG+M F(ab )2 ellenanyagot 5 µg/ml végkoncentrációban adunk a megfelelő mintákhoz, a csöveket pedig 45 percig jégen hagyjuk. Ez a szinkronizációs lépés biztosítja, hogy az ellenanyag minden mintában egyformán telítse a BCR-eket. Az aktivációhoz a mintákat adott időközönként 37 C-ra (CO2-termosztát) tesszük. Az aktiválást a leghosszabb idejű mintával kezdjük, és a legrövidebbel fejezzük be, hogy az aktivációs időknek egyszerre legyen végük. Ezután a sejteket hideg FACS pufferben 2x mossuk (1ml rpm 4 C), majd anti-humán IgM-FITC ellenanyagot adunk hozzájuk (2 µl/cső), és 20 percig fénytől védve, jégen hagyjuk. A sejteket ezután 1x mossuk, majd 300 µl ml FACS pufferben felvesszük, és elvégezzük az áramlási citofluoriméteres mérést. A minták: anti-humán IgG+M Aktiváció (37 C) α-humán IgM-FITC F(ab )2 1. Ø Ø Ø 2. Ø Ø Ø Feladat: Ábrázoljuk a sejtfelszínen expresszált BCR mennyiségét melyet áramlási citometriával határoztunk meg az aktiválást követően az idő függvényében és értelmezzük a görbét. 7

8 Fas-független apoptózis indukciója T sejtekben membrán stressz révén: az apoptózis néhány szelektív markerének áramlási citometriás és konfokális mikroszkópiás vizsgálata Az apoptózis az immunrendszerben különösen gyakran fellépő programozott sejthalál folyamat, melynek révén a funkcionálisan nem megfelelő, a szervezet sejtjeire veszélyes (autoreaktív) ill. a feladatukat már ellátott, vagy arra egyáltalán nem képes sejtek eliminálódnak az immunrendszer sejtkészletéből. Ez naponta akár több száz millió sejt (nagyrészt limfociták) folyamatos elhalását jelenti. Az apoptózis során a sejtek citotoxikus anyagokat nem ürítenek a környezetükbe, szemben a nekrotikus sejthalállal (ami a sejtek lízisével jár). Az apoptotikus sejteket a makrofágok felismerik sejtfelszíni lipid (ill. fehérje) mintázataik alapján és fagocitózis útján eltávolítják őket az immunrendszerből. Az apoptózis folyamán bekövetkező DNS fragmentálódás eredményeként megjelenő csökkent mértékű propidium-jodid festődést mutató, ún. szubdiploid (apoptotikus) populáció %-os arányát áramlási citométer segítségével vizsgálhatjuk. A folyamat beindulásának több jellegzetes markere is megfigyelhető mikroszkópiásan, többek között a sejtek plazma membránjának hólyagosodása (blebbing), majd késői fázisban a DNS fragmentálódása, apoptotikus testek képződése és leválása a sejtekről, valamint a plazma membrán permeabilizálódása ( szekunder nekrózis ). Ezeket a folyamatokat a membrán lipidek (pl. GM1 gangliozid) fluoreszcens jelzésével (Alexa-488 cholera toxin B alegység), ill. a spontán módon csak a permeabilizálódott sejtek által felvett viabilitás marker festék, a propidium jodid (DNS-be interkalálódik) fluoreszcenciája alapján vizsgálhatjuk. Sejtek, anyagok, eszközök: IP12-7 egér TH-hibridoma sejtek (2.5x10 5 /ml, RPMI komplett médiumban) RPMI komplett médium propidium-jodid törzsoldat (1 mg/ml) VIGYÁZAT, MUTAGÉN HATÁSÚ!!! PBS pufferoldat hipotóniás DNS-extraháló/festő oldat: 0.1 % Na-citrát, 0.1 % Triton X-100, 50 µg/ml propidium-jodid steril csövek; 24-lyukú sejttenyésztő lemez; 5 ml-es FACS csövek 5 μl (40 μg/ml törzsoldatból) Alexa488-cholera toxin B oldattal Metodika A: Az IP12-7 T sejteket RPMI médiumban inkubálunk (5x10 5 sejt/ml) apoptózis indukció céljából (37 C-on, CO2 termosztátban) 24 lyukú mikroplateben, kb. 24 órán át, 0, 12.5, 25 és 50 µm C2 ceramiddal, ami a sejthalál receptor (Fas) független apoptózis jelátvitel egyik mediátora. Az apoptotikusan indukált sejteket centrifugáljuk és mossuk hideg PBS-ben. A sejteket 5 ml-es FACS csövekbe pipettázzuk, PBS-sel egyszer mossuk (1200 rpm, 8 min), majd a fellazított sejtpelletre 500 µl propidium-jodid tartalmú DNS-extraháló/festő oldatot mérünk (KESZTYŰ AJÁNLATOS!!!), majd a mintákat +4 o C-on 3-4 óráig inkubáljuk, óránként felszuszpendálva (vortex). Áramlási citométeren mérjük a propidium-jodid fluoreszcencia intenzitását (gerjesztés 488 nm-en Ar + -lézerrel, detektálás a vörös (FL3) csatornában). Meghatározzuk az apoptotikus (DNS fragmentáción átesett, szubdiploid) sejtek százalékát, marker jel alkalmazásával 8

9 Metodika B: Az IP12-7 T sejteket RPMI médiumban inkubálunk (5x10 5 sejt/ml) apoptózis indukció céljából (37 C-on, CO2 termosztátban) 24 lyukú mikroplateben, kb. 24 órán át, 0, 12.5, 25 és 50 µm C2 ceramiddal, ami a sejthalál receptor (Fas) független apoptózis jelátvitel egyik mediátora. Az apoptotikusan indukált sejteket centrifugáljuk és mossuk hideg PBS-ben, majd festjük a sejt pelletet 5 μl (40 μg/ml törzsoldatból) Alexa-488 cholera toxin B oldattal, 5 percig 37 C-os vízfürdőben vagy 20 percig jégen, mindkét esetben letakarva, hogy fény ne érje. A sejteket mossuk 2 x hideg PBS-ben, majd hideg médiumban felszuszpendáljuk (kb. 500 μl) és közvetlenül mérés előtt 1 μl propidium jodid törzsoldatot (1 mg/ml) adunk hozzá a DNS festése céljából. Feladat: A membrán és DNS festett apoptotikus T sejtmintáról felvett CLSM képek elemzése. A mintában várhatóan találhatók ép sejtek (folytonos, gyűrűszerű membránfestés), ill. olyan sejtek melyekben már beindult az apoptózis, ill. a kb. 20 órás inkubáció alatt már el is jutott a DNS fragmentáció fázisába. Így a vörös színű magfestés alapján ezen sejtek egymás mellett jól értékelhetőek. A membrán festés alapján a membrán permeabilizálódása/propidium jodid pozitivitás, folytonossági hiányok, valamint a gyengébb vagy nem észlelhető festődés alapján a késői apoptózis/szekunder nekrózis azonosítható. A fragmentáció a DNS-t festő propidium jodid foltos intracelluláris festődése alapján deteketálható, szemben a még nem fragmentálódott sejtmagok homogén vörös festődésével.) A bleb -ek (hólyagok) képződése a morfológiai (DIC) kép alapján detektálható és jelzi a korai apoptotikus sejteket. 9

10 B-limfociták aktiválása a B-sejt receptoron keresztül anti-humán IgG+M F(ab )2 ellenanyaggal: az intracelluláris Ca 2+ válasz áramlási citometria segítségével. Sejtek, anyagok, eszközök: RAMOS humán IgM+ B-sejtvonal RPMI 1640 komplett médium GKN-oldat (NaCl, glükóz és fenolvörös tartalmú fiziológiás foszfátpuffer) tripánkék festék Anti-humán IgG+M F(ab )2 kecskében termelt poliklonális ellenanyag Fluo-4 AM törzsoldata (1 mg/ml), Pluronic F-127 tartalmú DMSO-ban oldva propidium-jodid törzsoldat (1 mg/ml) VIGYÁZAT, MUTAGÉN HATÁSÚ!!! Ionomycin (1 mg/ml) steril csövek; 5 ml-es FACS csövek Feladat: Aktiváljuk a B sejteket BCR-en keresztül anti-humán IgG+M ellenanyaggal. Alkalmazzunk egyre növekvő dózist a stimulálásra: 0, 1, 2,5 5, 10 µg/ml végkoncentrációk(!). Mérjük meg a kontroll (kezeletlen) és a kezelt sejtek intracelluláris Ca2+-szintjét (mérés: az FL1 csatornában, idő függvényében, 6 percig; halott sejtek negatívan kikapuzva PI DNS-festék segítségével (PI-pozitív sejtek az FL3 csatornában). Ábrázoljuk a görbék maximumát az anti- IgG+M dózis függvényében. Metodika: 1. A sejtek feltöltése Fluo-4 AM Ca2+-szenzitív fluoreszcens festékkel: 5x10 6 sejtet 0,5 ml médiumban felveszünk és 5 µl Fluo-4 AM festék hozzáadását követően 30 percig 37 oc-os vízfürdőben enyhe rázatás mellett inkubálunk. Ezután médiummal 10 ml-re egészítjük ki a sejtszuszpenzió térfogatát, és további 30 percig inkubáljuk 37 C-os vízfürdőben. Egyszeri hideg GKN-nel történő mosás után a sejteket 4 ml hideg médiumban vesszük fel, majd 0,5 ml-enként FACS méréshez használatos csövekbe mérjük és jégre helyezzük. 2. Az 5 perces 37 C-on való előmelegítés után a 0,5 ml sejtszuszpenzióhoz 1 µl propidiumjodid törzsoldatot adunk a halott sejtek mérés során való elkülöníthetősége érdekében. 3. A 0,5 ml térfogatú előmelegített sejtszuszpenziókhoz az alapjel (kb. 30 sec) regisztrálása után pipettázzunk anti-igg+m-t, hogy annak a végkoncentrációja rendre 0, 1, 2,5, 5 és 10 µg/ml legyen, majd folytassuk a Ca 2+ jel regisztrálását sec-os alapjel felvétele után 2 µl ionomycin (ionofór vegyület) hozzáadásával mérjük meg B-sejtek maximális Ca 2+ -jelét. 10

11 Molekuláris kolokalizáció (pl. MHCII glikoprotein és GM1 gangliozid raft lipid között) kimutatása A20 egér B limfóma (APC) sejtek membránjában konfokális lézerpásztázó mikroszkópiával (CLSM). Bevezetés, elméleti háttér: Receptorok, membránfehérjék kolokalizációjának analízise konfokális fluoreszcens mikroszkópiával A receptorok és egyéb membránfehérjék sejtfelszíni eloszlása gyakran informatív az aktivációs folyamatokhoz kötött un. aktivációs fehérje clusterek (több tíz-száz fehérje molekula csoportosulása) ill. funkcionális membrán mikrodomének kialakulása szempontjából. Ezeket a molekulacsoportosulásokat, ill. tetszőleges membránfehérjék előfordulását bennük, a konfokális fluoreszcens mikroszkópia segítségével is vizsgálhatjuk, természetesen az optikai mikroszkópia térbeli feloldási korlátai (min. 250 nm) mellett. Ez azt jelenti, hogy csak ilyen vagy az ennél nagyobb méretű clusterek/mikrodomének feloldására van lehetőség, a clustereken belüli molekuláris kapcsolatokat ezeken képeken közvetlenül nem tudjuk feloldani. A konfokális mikroszkóp tulajdonképpen a tárgylemezen elhelyezett, immuncitokémiai úton fluoreszcensen jelzett sejteken egy függőleges z irányú optikai szeletelést végez (az immunrendszer különféle sejtjeinél a vastagság, azaz a z irányú kiterjedés kb.1030 mikrométer, egy szelet tipikus vastagsága 200 nm, de ez tetszés szerint változtatható), azaz több fókuszsíkból gyűjt be információt a szelet x,y irányú, pontszerű lézersugárral történő pásztázásával, miközben az éppen pásztázott síkon kívüli térrészből érkező fluoreszcens fényt (háttérzaj) optikai úton (pontszerű rés, pinhole a detektor előtt) kiszűri. Az így előállt optikai szelet képek számítógép segítségével 3 dimenziós kép formájában rekonstruálhatók. Ez a vizsgálati módszer előnyösen alkalmazható teszőleges sejtfelszíni (vagy akár intracelluláris) fehérje lokalizálására, kolokalizására más fehérjékkel (vagy intracelluláris organellumokkal), ill. membrán mikrodoménekkel (pl. caveola, lipid raft). A módszer alkalmazását itt az MHCII molekula lipid raftokkal (marker: GM1 gangliozid, fluoreszcens cholera toxin B-vel jelölve) való kolokalizációjának demonstrálásán keresztül mutatjuk be, de bármely két tetszőleges fehérje között is hasonló módon végezhető el a vizsgálat. Anyagok, Reagensek, Eszközök: a vizsgálni kívánt sejt/sejtvonal szuszpenzióban izotóniás, foszfátpufferelt sóoldat (PBS, ph: 7.4) fluoreszcens festékkel konjugált monoklonális ellenanyag (FmAb) a vizsgálni kívánt fehérje ellen fluoreszcens festékkel konjugált cholera toxin B (40 μg/ml, frissen hígitva 1 mg/ml törzsoldatból, mely utóbbi aliquotjai 200Con 6 hónapig tárolhatók) Fc receptort expresszáló sejtek esetén Fc receptor blokkolására alkalmas ellenanyag vagy Fc preparátum 50 ml-es Falcon cső, 1.5 ml-es Eppendorf csövek hűthető centrifuga 4 vagy 8 osztatú microplate, amely alkalmas a mikroszkópra felszerelt hőmérséklet és CO 2 szabályozó egység használatára 10µg/ml fibronectin a microplate-ek felszínének bevonására inverz fluoreszcens mikroszkóp konfokális pásztázó egységgel és megfelelő hullámhosszakra érzékeny fotomultiplier detektorokkal ellátva 11

12 lézer fényforrások (488 nm Argon, 543 nm HeNe-Green és 632nm HeNe-Red lézer) és megfelelő szűrőkockák (dichroikus tükör/ emissziós szűrő kombináció) a kétféle fluoreszcencia detektálására A digitális képek felvételére és kiértékelésére alkalmas szoftver Zeiss LSM5/Axiovert 200, Olympus Fluoview 300/500/IX81. A módszer leírása: A sejteket megszámoljuk, és mintánként 5x10 5 sejt/ml koncentrációt állítunk be, 1.5 ml-es Eppendorf csövekben, majd lecentrifugáljuk (1300g, 7 perc, 4 C). A sejtpellethez megfelelő (telítési) mennyiségű fluoreszcens ellenanyagot (pl. FITC anti MHCII) és egyidejűleg 5 μl Alexa-647 cholera toxin B-t adunk, majd összekeverést követően, jégen 20 percig inkubáljuk. A jelölést követően a sejteket saját médiumban 2x mossuk. A kettősen jelölt sejtmintát 4% formaldehiddel fixáljuk (szobahőmérsékleten, kb. 20 perc), majd a fibronectinnel előkezelt (ON, szobahőn) microplate lyukaiba pipettázzuk. A microplate-et a hőmérséklet és CO2 szabályozó készülékbe majd a konfokális mikroszkóp tárgyasztalára helyezzük. A konfokális mikroszkópban a minta fluoreszcens képe alapján megkeressük a lemezzel érintkező ún. fenék síkot (csökkenés után éppen eltűnő fluoreszcencia), majd felfelé lépegetve a tetősíkot, és meghatározzuk, hogy milyen szeletvastagságot kívánunk beállítani. Erre a kb. 200 nm érték javasolt. Ezután a mikroszkóp automatikusan pásztázza a kijelölt síkokat, ill. összeállítja a síkokból a 3D rekonstrukciót. A kettősen jelzett sejtek fluoreszcens képét regisztráljuk a mikroszkóp optikai csatornáiban, digitális formában, az előző pontban említett módon. (A festékek esetleges spektrális áthallásának ellenőrzésére a felvételeket szekvenciális üzemmódban készítsük.) Célszerű ezen mérésekhez nagy numerikus appertúrájú, immerziós olajos objektívet (60 x nagyítás) alkalmazni. Vizsgáljuk a kolokalizáció mértékét a két optikai csatornában felvett képek pixelhelyes fedésbe hozásával /overlay/ vizuálisan (pl. zöld és vörös szín esetén az adott pixelben történő együttes előfordulás esetén narancssárga szín észlelhető). A kolokalizáció mértéke kvantitatívan is értékelhető, a két képen kijelölt, adott koordinátájú pixelben megjelenő, a detektálási küszöböt meghaladó zöld ill. vörös fluoreszcencia intenzitásának keresztkorreláció analízisével (pl. Image J (NIH, USA) szoftver, vagy az adott mikroszkóp kolokalizációs index értékelő programja). A módszer kritikus pontjai Célszerű a vizsgált fehérjékre nézve specifikus, keresztreakciót nem mutató, monoklonális antitestek használata. Fontos az ellenanyaggal való jelöléseket hidegen végezni, ill. a sejtek azonnali fixálása, az antitest internalizáció minimalizálása céljából. Fontos olyan festékek választása, melyek emissziós spektrumai jól elkülönülnek egymástól (nincs áthallás egymás optikai csatornáiba). A kiértékelést (ld. alább) szokásos ekvatoriális optikai szeleten (a sejt középmagasságában) is elvégezni, de célszerűbb a kétféle szín (szomszédos, szeleten belüli síkokból történő) véletlenszerű egymásravetülését kiküszöbölendő egy a sejt felszínéhez közeleső szeleten (is) elvégezni azt. Az eredmények értékelése A két, spektrálisan izolált, csatornában (pl. zöld:x,vörös:y) a kettősen jelölt sejtmintáról digitálisan rögzített képek esetén a kolokalizációt a keresztkorrelációs koefficiens (C) értéke alapján kvantitatívan is megítélhetjük. A koefficiens definíciója C = Σ i Σ j (x i,j - <x>) (y i,j - <y>) / Σ i Σ j (x i,j - <x>) 2 Σ i Σ j (y i,j - <y>) 2, ahol x i,j ill. y i,j az i és j koordinátákkal jellemzett pixel fluoreszcencia értékei az x (zöld) ill. y (vörös) képen. A kiértékeléskor csak a detektálási küszöb fölötti értékekkel rendelkező pixeleket vesszük figyelembe a summázás során. A C elméleti 12

13 felső értéke 1, ami két teljesen azonos kép esetén adódik, míg a 0 ill. ahhoz közeli érték a kétféle festék (jelölt molekula) szeparált lokalizációjára utal. A módszer alkalmazási lehetőségei A módszer alkalmas az immunrendszer legtöbb sejtje (pl. T, B limfociták, hízósejtek, makrofágok) esetén két tetszőleges sejtmembránban expresszált fehérje (vagy lipid) kolokalizációjának vizsgálatára pixelenként. A módszer 10 4 fehérje/sejt expresszió alatt korlátozottan alkalmazható az esetleges alacsony fluoreszcencia jelszint miatt. Kísérlet: A20 egér B sejteket anti-mhcii (IA) ellenanyaggal jelöljük a fentiekben leírt módon, egyidejűleg a fluoreszcens cholera toxin B-vel, mely utóbbi a plazma membrán GM1 gangliozidok (raft marker lipid) jelölésére szolgál. A sejteket a jelölés után fixáljuk, majd a sejtkamra lyukaiba cseppentjük. Konfokális mikroszkóp két szeparált optikai csatornájában (zöld és vörös fluoreszcencia) vizsgáljuk a sejtek fluoreszcencia képét ( ekvatoriális, tető és fenék szelet fókuszsíkok), majd a leírt módon pixelenként értékeljük a kétféle fluoreszcencia együttes előfordulását. Megjegyzés: A kolokalizáció magas foka nem jelent bizonyítékot a kétféle molekula fizikai asszociáciációjára/kölcsönhatására (ez csak a fluoreszcencia rezonancia energia transzfer /FRET/ technikával vizsgálható megbízhatóan), pusztán azt jelzi, hogy a két molekula milyen mértékben fordul együttesen elő egy pixel méretnyi térelemben (min. 0.1 x 0.1 mikrométernyi terület, amely a membrán raft mikrodomének mérettartományával összemérhető). 13