Vércsoportszerológiai alapfogalmak. Dr. Csépány Norbert Transzfúziós tanfolyam Debrecen

Átírás

1 Vércsoportszerológiai alapfogalmak Dr. Csépány Norbert Transzfúziós tanfolyam Debrecen 1

2 Vércsoportszerológia Az immunológia tudományának speciális ága, mely a vörösvérsejtek felületi antigénjeivel, és az ezek ellen termelődő, ezekkel reagáló antitestekkel, illetve in vitro antigén-antitest reakciókkal foglalkozik 2

3 Alapfogalmak Antigén bármely anyag, mely a szervezetbe jutva immunválaszt vált ki Antitest az immunrendszer által antigén hatására termelődőtt molekula - a fehérjék immunglobulin családjába tartoznak Antigén determináns (epitóp) az antigén azon része melyet egy adott B-sejt receptor vagy T-sejt receptor felismer Hordozó az antigénnek a receptorokkal közvetlenül nem reagáló része 3

4 Immunrendszer 4

5 Immunrendszer Cél: az antigének eltávolítása Immunválasz: felismert antigén kiküszöbölése saját idegen struktúrák megkülönböztetése Az immunválasz szakaszai: 1. Kognitív szakasz 2. Centrális szakasz 3. Efferens szakasz 5

6 Immunválasz szakaszai 6

7 Vérképzés 7

8 Veleszületett immunitás Adaptív immunintás Fő alkotóelemek Fő alkotóelemek Komplement rendszer Hő-shock fehérjék Makrofágok Granulociták Regulatorikus citokinek NK sejtek Funkcionális jelleg Nem antigén specifikus Nincs immunológiai memória Gyors reakció Lineáris erősítés Limfociták (B és T) Antigén prezentáló sejtek Funkcionális jelleg MHC T sejt és B sejt antigén receptorok Gyulladásos citokinek Antitestek Fc receptorok Antigén specifikus Immunológiai memória Latencia után aktiválódik Exponenciális erősítés 8

9 Immunválasz Elsődleges IgM Ellenanyag affinitás alacsony Másodlagos IgG Ellenanyag affinitás magas 9

10 B-sejt aktiváció 10

11 Immunglobulinok termelődése 11

12 B-sejtes immunválasz 12

13 Komplement rendszer 13

14 Komplement rendszer 21 inaktív fehérje,melyek egymást aktiválják Az antigén antitest reakció a komplement rendszert a klasszikus úton aktiválja 14

15 Antitestek (Immunglobulinok) - plazmasejtek termelik - fehérjék, gamma globulinok - 2 könnyű és 2 nehéz lánc - nyaki kapocs (hinge) régió - másodlagos kötések - 5 alosztály IgM, IgG, IgA, IgD, IgE - 2 könnyű lánc (kappa, lambda) - komplement aktiváció - antitesttel fedett vvt makrofágok általi felismerése 15

16 Immunglobulinok F(ab) és Fc fragmentek F(ab) antigén kötés Fc effektor funkciók Fc régió hiányában az immunglobulin nem képes komplentet aktiválni, phagocitózist indukálni Pepszin után képes lehet agglutinációra F(ab')2 bivalens szerkezet 16

17 Immunglobulin osztályok 17

18 IgG 4 alosztály, monomer 75% Antigén kötés nélkül T alak Antigén kötődés után Y alak IgG3 hosszú nyaki rész Leggyakoribb Ig a vérben (1g/ttkg) Áthatol a placentán IgG1 és IgG3 erős komplement aktiváló IgG2 gyengébb, IgG4 nem aktivál komlementet Félélet idő: 21 nap 18

19 IgM - Pentamer szerkezet - J lánc - 10% - Nem megy át a placentán - Komplentet az IgG-nél erősebben aktivál - összes IgM 74%-a intravaszkularisan - félélet idő: 5 nap 19

20 IgA Általában dimer forma (monomer is lehet) Két alosztály IgA1 és IgA2 Szekrétumokban főleg Szerológiai reakciókban megjelenhet Félélet ideje 6 nap IgD Szabad formában nem található meg a vérben B sejtek receptora, antigén ezen keresztül aktiválja a B sejtet 20

21 Antitestek osztályozása Autoantitest Saját antigénnel szemben termelődik Alloantitest Idegen, de saját fajon belüli antigénnel szemben Xenoantitest Más fajon belüli antigénnel szemben 21

22 Vércsoportszerológia kezdete Karl Landsteiner 22

23 A vér antigén rendszerei Sejtek: - vörösvérsejt antigének - thrombocita antigének - fehérvérsejt antigének Szolubilis antigének: plazmafehérjék, szénhidrátok, zsírok 23

24 Vörösvérsejt membrán Egyéb sejtekhez hasonlóan alapja a lipid kettős réteg Foszfolipid 60% Koleszterin 30% Glikolipidek 10% Ebben a kettős rétegben találhatók meg a vércsoport antigének 24

25 Vércsoport antigének A vércsoport tulajdonságok a vörösvérsejteken, fehérvérsejteken, trombocitákon, vérfehérjéken megjelenő egyediséget kifejező öröklött jellegek. Jellemző a Mendeli öröklődés (domináns recesszív vagy intermedier) Egyedfejlődés során különböző időben jelennek meg Rh rendszer antigénjei születéskor már jelen vannak ABO rendszer antigénjeinek száma születéskor még alacsonyabb, mint későbbi életévekben 25

26 Vércsoport antigének Vércsoport antigének - poliszacharidok, polipeptid, glikoprotein 26

27 Vércsoport antigének funkciói Diego anion csere Kidd urea transzport Colton aquaporin 1 transzporter Duffy Plasmodium vivax receptora Kell cink kötő endopeptidáz Rh vörösvérsejt membrán stabilitás 27

28 Vörösvérsejt antigének A vércsoportok között a vvt-ken megjelenő antigénszám különböző - ABO antigének 1-2 millió/vvt - M,N antigének 500 ezer/vvt - I antigén ezer/vvt - D, S, Duffy, Kidd ezer/vvt 28

29 Vércsoportrendszerek A napjainkig a vörösvérsejteken kimutatott több mint 500 antigént az ISBT a következő csoportokba sorolja: Vércsoport rendszerek (30 vércsoport rendszer) Vércsoport antigén kollekciók Ritkán előforduló antigének Nagy gyakorisággal előforduló antigének 29

30 Vércsoportrendszer klinikai jelentősége ABO rendszer Rh rendszer Immunogén rendszerek (Kell, Duffy, Kidd) ABO társrendszerei (Lewis, P, Lutheran) 30

31 Vércsoportrendszerek jelentősége Orvostudomány szempontjából: Transzfúziós Transzplantációs (ABO antigének szöveti sejteken) Igazságügyi orvostani Antropológiai szempontok Transzfúziós szempontból az antitest okoz-e: Hemolítikus transzfúziós szövődményt Újszülöttkori hemolítikus betegséget 31

32 Vércsoport antigének tulajdonságai Antigén specificitása - epitóp határozza meg Immunogenitás (antigenitás) - antigén milyen mértékben vált ki immunválaszt - anitgén kémiai szerkezete és molekulasúlya határozza meg - tiszta fehérje Rh antigén a legimmunogénebb, már 1 ml vér is elegendő az immunizáláshoz - cukor tartalmúak immunogenitása kisebb, legkevésbé immunogének a lipid tartalmú antigének - terhességben az antigének megjelenése is fontos tényező Antigén valencia antigén sűrűség a vvt-n 32

33 Az antigének eliminációja: ag-at reakció in vivo következményei - Neutralizáló antitestek semlegesítik az Ag-t - Immunkomplexek aktiválják a komplement rendszert, vörösvérsejteket elpusztítják az érpályán belül (intravazális hemolízis)- IgM - Antitestek aktiválják a monocyta/macrophag rendszert (extravazális hemolízis)- IgG - ADCC (antitest dependens celluláris citotoxicitás): az antitestek opszonizálják a sejtet, és aktiválják az Fc receptorral rendelkez citotoxikus sejteket (monocyta/macrophag, granulocyta, NK-sejt). 33

34 Vércsoport szerológia Az immunológia egyik ága, mely a vércsoport antigénekkel és az általuk kiváltott immunválasz in vivo és in vitro megnyilvánulásaival foglalkozik. 34

35 Antigén antitest reakció in vitro Agglutináció!!! Hemolízis Abszorpció Elúció 35

36 Agglutináció Agglutináció alatt a korpuszkuláris antigének ellenanyagokkal történő kapcsolódásakor létrejövő összecsapódást értjük. E tekintetben az antigént agglutinogénnek, az ellenanyagot pedig agglutininnek nevezzük. 36

37 Agglutináció fázisai 1. Specifikus fázis: 2. Aspecifikus fázis: Ag-At kötődés Immunkomplexek kialakulása összekapcsolódása, térrács kialakulása 37

38 Komplett és inkomplett hemagglutáció - IgM: ag-at reakció, rácsszerkezet látható agglutináció - IgG:ag-at reakció kialakul, de a szuszpenzió homogén, térrács nem alakul ki, mivel az IgG 2 karja között kicsi a távolság és a térrács kialakulásához 2 különböző epitóphoz kell kapcsolódni Megoldás az AHG! 38

39 Agglutinációt befolyásoló tényezők Reakcióhő - hideg típusú antitestek (0-4 C) - meleg típusú antitestek (37 C) Reakcióidő - antigén antitest kötődéshez szükséges idő - függ a vércsoporttól, módszertől, vizsgálati technikától Antigén antitest arány A vizsgálatokban az antitest túlsúly kívánatos 39

40 Agglutinációt befolyásoló tényezők Közeg - komplett agglutinin fiz. Só - inkomplett agglutinin - LISS (alacsony ionerejű oldat) - albumin - enzimkezelés (papain, bromelin) - AHG (Coombs) 40

41 Agglutinációt befolyásoló tényezők Fiziológiás sós közegben az IgM ellenanyagok agglutinálnak Az IgG ellenanyagok kötődnek az antigénhez, de nem agglutinálnak. ABO rendszer és hideg antitest vizsgálat 41

42 Agglutinációt befolyásoló tényezők LISS= low ionic strengh solution Hatása: növeli a sejt felszint (a sejt megduzzad) csökkenti az elektromos kettős réteget közelebb hozza a sejteket szabaddá tesz antigéneket gyorsitja az antitestek kötődeset 42

43 Agglutinációt befolyásoló tényezők Proteolitikus enzimek papain bromelin Hatás: csökkentik a felszin negativ töltését szabaddá tesznek antigéneket (Rh, Kidd) Elroncsolnak antigéneket (Duffy, MNS) ELLENANYAGSZŰRÉS 43

44 Agglutinációt befolyásoló tényezők A vizsgált vérminta kora A vvs-ek agglutinabilitása idővel csökken a szobahőmérsékleten tárolt vérminta 24 óráig hűtőben tárolt nativ vérminta óráig A szerológiai vizsgálatok alapja a megfelelően levett és címkézett vérminta!!! A vizsgált egyén kora, állapota Idős korban az agglutinabilitás csökken Bizonyos betegségekben csökken vagy nő 44

45 Vércsoport szerológia Szerológiai szempontból fontosabb antitestek: IgG, IgM, ritkán IgA 45

46 Antitestek jellemzői Megjelenés szerint - természetes antitestek - immunantitestek Savóban való jelenlét alapján - reguláris antitestek - irreguláris antitestek Hőoptimum alapján - hideg antitest - meleg antitest 46

47 DAT Direkt Antiglobulin Teszt Direkt Coombs DC Immunantitestek kimutatása sokáig sikertelen volt In vivo, már a szervezetben kialakult antitesttel való fedettség kimutatására szolgál ABO azonos transzfúziók szövődmény továbbra is Inkomplett antitestek kimutatása Anti-humán-globulinnal! 47

48 DAT AHG lehet: - polispecifikus több osztály ellen (anti-igg és anti-c3d) - monospecifikus egy fajta immunglobulin vagy komplement frakció 48

49 DAT 49

50 DAT pozitivitás okai Transzfúziós szövődmény (alloantitest) Transzfúzió előtti minta DAT -, utáni pedig DAT transzfúziós szöv. Terhességi alloimmunizáció Anaemia, sárgaság, magzati elhalás Autoimmun hemolitikus anaemia (autoantitest) Antitest lehet aspecifikus, de gyakori az Rh rendszer elleni antitest Gyógyszer okozta pozitivitás penicillin, fenacetin, cefalosporin, metildopa Passzívan bevitt antitest, aspecifikus reakció 50

51 IDAT (Indirekt Antiglobulin Teszt) In vitro A savó inkomplett antitestjeinek kimutatása Ellenanyag szűrés és azonosítás Kompatibilitási vizsgálat (keresztpróba) Antigén vizsgálatok (Duffy, Kidd) 51

52 DAT és IDAT 52

53 Agglutináció értékelése Pozitív reakció: agglutináció jelenléte, erősségét keresztekkel jelölik ( ) antigén-antitest kötődésre utal Negatív reakció: agglutináció hiánya, nincs antigén-antitest kötődés Kevert mező: - nem csoportazonos vér transzfúzióját követően - hematológiai betegség esetén - chimerizmus 53

54 Hemolízis Az antigén antitest kötődés olykor hemolízist eredményez, melyet tévedésből negatív reakciónak nézünk. A hemolízis szintén pozitív szerológiai reakció! (körömlakk, "meggyszörp") Hemolítikus vérminta szerológiai vizsgálathoz nem használható! 54

55 Laboratóriumi metodikák Lemezes módszer - Csempe - Bed side kártya Csöves meghatározás Microplate Gél kártya 55

56 Laboratóriumi metodikák 56

57 Laboratóriumi metodikák Bármilyen módszerrel dolgozunk mindig be kell tartani a gyártó utasításait! Használat előtt ellenőrizzük a mintánkat és a használandó reagenseket! (lejárati idő, küllem, megfelelő tárolás) A szerológiában az autokontrollok és a reagens kontrollok használata kötelező! 57

58 Hibaforrások Technikai hiba ismétlés Adminisztratív hibák Nem felismert kevert mező, hemolízis Lejárt vagy szennyeződött reagensek Álnegatív reakciók Álpozitív reakciók 58

59 Kontrollok a szerológiában Használatuk biztosítja, hogy a vizsgálatban megjelenő agglutináció vagy annak elmaradása kizárólag antigén antitest kapcsoltság eredménye. Kontrollok a szerológiában: - agglutinációs vagy autokontroll - reagenskontroll - negatív, illetve pozitív kontroll - különböző quality kontrollok 59

60 Autoagglutinációs kontrollok Autokontroll alatt a vizsgálni kívánt vörösvérsejt saját savójával adott reakcióját értjük. Használata a fals pozitív eredmény kiszűrését biztosítja. A reakciónak minden esetben negatívnak kell lenni, ellenkező esetben a reagenssel kapott eredmény nem értékelhető. Pozitív az autokontroll, ha: - a vizsgált vvt auto vagy alloantitesttel fedett - a savó sympexis képző tulajdonságú 60

61 Reagens kontrollok Reagens antitest + adalékok A reagenshez képest a kontroll ugyanolyan összetételű ( kivéve antitest nincs benne) Ált. Antigén kimutatáskor használjuk Reakció esetén az agglutináció nem az antitest és a neki megfelelő antigén kötődésének az eredménye. A vizsgálat nem értékelhető 61

62 Pozitív - negatív kontroll A szerológiai vizsgálatokban már előzetesen ismert pozitív és negatív tulajdonságú minta alkalmazása Fals eredmények kiszűrése Pl. antigén státusz meghatározásakor Az eredmény akkor elfogadható, ha a pozitív és negatív kontroll is megfelelő eredményt ad 62

63 Quality kontrollok A laboratórium munkájának minősítő kontroll Lehet belső vagy külső Kiterjedhet készülékre, reagensre, metodikára 63

64 Sympexis Sympexis pénztekercs képződés Nem antigén antitest reakció Fals pozitív eredményt adhat Albumin/globulin arány megváltozik Kóros fehérjék (myeloma, cirrhozis, malignomák) Makromolekulák (dextrán, kontrasztanyag) Fiz. Só hozzáadása és döntögetés Keverni tilos! 64

65 Köszönöm a figyelmet! 65