Korszerű tömegspektrometria a. Szabó Pál MTA Kémiai Kutatóközpont

Átírás

1 Korszerű tömegspektrometria a biokémi miában Szabó Pál MTA Kémiai Kutatóközpont

2 Tematika Bevezetés: ionizációs technikák és analizátorok összehasonlítása a biomolekulák szemszögéből Mikromennyiségek mintaelőkészítése Intakt fehérjék vizsgálata: lehetőségek és korlátok Enzimatikus és kémiai hasítások oldatban és gélben Peptidtérkép készítése, szekvenciameghatározás Kromatográfia a mikro illetve nano tartományokban Peptidek tandem tömegspektrometriás szekvenálása Poszttranszlációs módosítások vizsgálata: metilálás, diszulfid hidak, foszforilálás, glikozilálás Fehérjekomplexek vizsgálata Enzimek aktív centrumának meghatározása Nukleinsavak vizsgálata Egyebek

3 Az MS felépítése Adatgyűjtő rendszer Mintabevitel Ionforrás Analizátor Detektor Vákuumrendszer Interface

4 Ionforrás Cél: Töltött részecskék előállítása Ionizációs módok: elektronütközéses ionizáció (EI) kémiai ionizáció (CI) gyors atom bombázás (FAB) lézerdeszorpció (LDI, MALDI) ionizáció légköri nyomáson (API) electrospray ionizáció (ESI) légköri nyomású kémiai ionizáció (APCI) photospray ionozáció (PSI)

5 Gyors atom bombázás Cél: kiterjeszteni a vizsgálható vegyületek körét Megoldás: mátrix bevonása az ionképzésbe Mátrix: glicerin, NOBA Tömeghatár: néhány ezer Da Fragmentáció: kismértékű Gyors atom/ion: Xe, Cs Kvázi-molekulaion: [MH], [MNa],

6 Gyors atom bombázás

7 Lézerdeszorpció Matrix Assisted Laser Desorption Ionization- Time of Flight Mass Spectrometry Leggyakoribb mátrixok: 4-hidroxi-a-ciano fahéjsav (CHCA) 2,5-dihidroxi benzoesav (DHB) Mátrix-minta kristályok a targeten 3,5-dimetoxi-4-hidroxi fahéjsav (SA)

8 MALDI ionképz pződés Mintatartó hn AH Laser 1. A mátrix-minta oldatot rászárítjuk a mintatartóra. 2. Laserimpulzus hatására molekulák lépnek ki a gázfázisba. 3. A minta molekuláit a mátrix ionizálja, majd az elektrosztatikus tér felgyorsítja. 20 kv Rács Rács 4. Repülési idő (TOF) tömegspektrometriás detektálás.

9 A MALDI előnyei Lágy ionizáció: intakt biomolekulák vizsgálata lehetséges Széles tömegtartomány: nagy móltömegű biomolekulák (> 300 kda) vizsgálata Keverékek egyidejű vizsgálata lehetséges, nem igényel bonyolult tisztítást, elválasztást Nagy érzékenység (fmol tartomány) Könnyen értelmezhető spektrumok (kis töltöttség) Sók, pufferek hatása kisebb Gyors

10 Tipikus MALDI spektrum [M2H] Voyager Spec #1=>NR(2.00)=>RSM100[BP = , 3562] [MH] pmol lineáris mód 25 kv gyors. fesz % Intensity [M3H] [2M3H] [2MH] Mass (m/z)

11 Ionizáci ció légköri nyomáson

12 Electrospray ionizáci ció IonSpray: (Pneumatikusan segített electrospray) Nagyfeszültség (5-6 kv) hatására töltött cseppek kerülnek a gázfázisba (koncentrációérzékeny!). Áramlási sebességek: TurboV (2µL/min 3mL/min) Turbo-IonSpray (2µL/min 1mL/min) IonSpray (2 to 200µL/min) Micro-IonSpray (50 to 1000 nl/min) NanoSpray (~1µL-5µl in tip, nl/min) Kis áramlás fi nagyobb érzékenység!

13 Turbo V TM Áramlási tartomány: µl/min

14 TurboIonSpray TM Áramlási tartomány: µ L/min

15 IonSpray TM Áramlási tartomány: µ L/min

16 Microelectrospray Áramlási tartomány: nl/min

17 Nanospray Áramlási tartomány: nl/min

18 Microtechnikák másként

19 Sprayképz pződés légköri nyomás 1. töltött cseppek képződése 3. Coulomb robbanás vákuum 2. oldószereltávolítás

20 Oldószerelt szereltávolítás Nitrogén gázfüggöny

21 Gázfüggöny interface légköri nyomás CUR DP SK vákuum Q0 FP N 2

22 Oldószerelt szereltávolítás Fűtött kapilláris Párologtató gáz HPLC eluens Spray Fűtőegység Szárítógáz Fűtött kapilláris

23 Többszörösen sen töltt ltött tt ionok Lágy ionizáció m/z = (M nh )/n

24 Rekonstruált tömegspektrumt

25 Eluensmódos dosítók Szerves savak (hangyasav, ecetsav) elősegítik a bázikus vegyületek (sp 3 N-tartalmú) protonálódását. Semleges együletek kationok (alkálifém, ammónium) segítségével is képezhetnek ionokat. 0.1 % hangyasav vagy ecetsav a legjobb adalék pozitív módban peptidek, fehérjék vizsgálatára, a 0.1% TFA HPLC-MS méréseknél kedvelt. Ammónium-formiát vagy-acetát javasolt puffernek 2-10 mm koncentrációban. Foszfátpuffer, TEA kerülendő!!!

26 Sóhatás