Fehérjék glikozilációja, a cukorláncok heterogenitása, és ennek tömegspektrometria alapú vizsgálata

HTML
DOWNLOAD

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Fehérjék glikozilációja, a cukorláncok heterogenitása, és ennek tömegspektrometria alapú vizsgálata"

Sára Kisné
8 évvel ezelőtt
Látták:

1 Fehérjék glikozilációja, a cukorláncok heterogenitása, és ennek tömegspektrometria alapú vizsgálata Vékey Károly és Drahos László MTA Természettudományi Kutatóközpont Budapest

2 szénhidrátok N-glikoproteinek O-glikoproteinek protein-glikáció, stb. fehérjék

N-glikoproteinek Gyakori poszt-transzlációs módosulás Heterogén cukorszerkezetek Biológiai szerepük jelentős, de ez csak részben ismert Fehérje alapú

3 N-glikoproteinek Gyakori poszt-transzlációs módosulás Heterogén cukorszerkezetek Biológiai szerepük jelentős, de ez csak részben ismert Fehérje alapú gyógyszerek egyik legfontosabb jellemzője proteinek tulajdonságait módosítják a sejtek közötti kommunikáció, immunválasz egyik fő eszköze számos betegségben szerepük van

4 Publikációs statisztika Publikációk száma évente glycosylation Web of science A glikoziláció tudományterülete gyorsan fejlődik

5 N-glikoproteinek analízise cukorláncok vizsgálata peptidlánc vizsg. adott fehérje, adott pontján levő cukorláncok leírása fehérjespecifikus glikoziláció a mintában levő összes szénhidrát helyspecifikus glikoziláció jelentős heterogenitás proteolitikus emésztést követően gyakorlatilag csak MS nehéz, bonyolult az esetek 1%-ban tömegspektrometrián alapul overall gliko mintázat gyakran a cukorlánc lehasítása után számos kísérleti technika leggyakrabban alkalmazott egyszerű, gyakori megoldás kromatográfia, elektroforézis

6 A tömegspektrometria

7 Publikációs statisztika Publikációk száma évente Publikációk számának változása glycosylation glycosylation + MS Web of science A tömegspektrometria szerepe a glikoziláció vizsgálatában fontos, kiemelkedően gyorsan növekszik Szélesebb körben használják, mint a kromatográfiát és az elektroforázist A helyspecifikus glikozilációval csak a cikkek 1% foglalkozik, ez gyorsan bővül (technikai lehetőségek változása)

8 Helyspecifikus glikozilációs mintázat A vizsgálat elve: A fehérje proteolitikus emésztése, majd A glikopeptidek tömegspektrometriás analízise A vizsgálat előnyei: Új, részletes, korábban ismeretlen info A fehérje izolálása nem szükséges; a vizsgálat keverékekben is elvégezhető Szennyezések nem zavarnak A vizsgálat hátrányai: Módszerfejlesztést igényel, időigényes Izomerekről ( linkage analysis ) csak korlátozott info A proteomikában megszokottnál szer kevésbé érzékeny (pmol mennnyiségű anyagot igényel)

9 A vizsgálat menete Mintaelőkészítés Humán várplazma A (gliko)proteinek frakcionálása (RP-HPLC) A frakciók tripszines emésztése, így komplex peptid-glikopeptid elegyhez jutunk Nano-UHPLC-MS(MS) analízis Több, egymást követő HPLC-MS vizsgálat Számítógépes értékelés Az eredmények értékelése a szűk keresztmetszet Saját fejlesztésű algoritmus és szoftver (Glycominer és Glycopattern; felhasználó) Az eredmények alapján új MS és MS/MS kísérletek

% % A HPLC-MS/MS mérés 13.11 27.26 30.37 30.44 kromatogramm 100 47.41 komponens-szelekció 24.18 24.36 31.09 12.57 12.42 14.90 18.00 23.64 31.48 33.66 43.51 44.73 39.06 49.17 51.02 56.71 52.24 57.

10 % % A HPLC-MS/MS mérés kromatogramm komponens-szelekció Time Time MS/MS spektrum MS-spektrum

11 Az értékelés elve és logikája Glikoproteinek azonosítása std. MS/MS, Mascot rutin Glikopeptidek azonosítása std. MS/MS, Glycominer nem rutin glikopeptidek: kis mennyiség, kis érzékenység Oligoszaccharid struktúrák hely- és protein-specifikus azonosítása speciális MS/MS, Glycominer kihívás MS/MS spektrumok automatikus értékelése interferenciák kiszűrése retenciós idők figyelembe vétele Helyspecifikus glikozilációs mintázatok meghatározása Speciális MS, Glycopattern kihívás kvantitatív mérések, interferenciák kiszűrése

12 Eredmények 1: Különböző fehérjék helypecifikus glikozilációs mintázata

13 Eredmények 2: helypecifikus mintázatok különböző emberekben

14 Eredmények 3: ~5000 glikoforma-intenzitást azonosítottunk és értékeltünk

15 NEEYNK AGP Értékelés: Korrelációk és következtetések Fukoziláció mértéke: AGP, 2 helyzet Fukoziláció mértéke: TRFE vs. AGP LVPVPITNATLDR TRFE Az egyes fehérjék és egyes helyek eltérő mértékben fukoziláltak kék: egyedi minták narancs: betegcsoportok A fukoziláció mértéke jól korrelál: - van, aki nagy mértékben, - van aki kevéssé fukozilált Jól értelmezhető a fukoziláció mechanizmusával

16 TRFE - QQQHLFGSNVTDcSGNFcLFR TRFE QQQHLFGSNVTDcSGNFcLFR-BiS2F Értékelés: Nem mindenki korrelál... Triantennás láncok rel. mennyisége Adott típusú fukoziláció TRFE - cglvpvlaenynk AGP LVPVPITNATLDQITGK-TriS2F Sok esetben a paraméterek nem korrelálnak egymással kék: egyedi minták narancs: betegcsoportok Egyes helyek-szerkezetek konzervativak, mások variábilisak

17 Összefoglalás és kitekintés Glikoproteinek helyspecifikus glikozilációja fontos információt nyújt alig vizsgált, új irányzat Tömegspektrometria (nano-hplc-ms/ms) + saját algoritmusfejlesztés

Köszönet: Kollégák, diákok Ács A, Drahos L, Gömöry Á, Gulyássy P, Ozohanics O, Révész Á, Tóth E, Turiák L, Újszászy K Berényi L, Bihari M, Bobály B, Budai L, Czuczy N, Dobó A, Gömöry Á, Imre T, Jakab

18 Köszönet: Kollégák, diákok Ács A, Drahos L, Gömöry Á, Gulyássy P, Ozohanics O, Révész Á, Tóth E, Turiák L, Újszászy K Berényi L, Bihari M, Bobály B, Budai L, Czuczy N, Dobó A, Gömöry Á, Imre T, Jakab A, Jekő A, Kiss A, Krenyácz J, Együttműködő partnerek Averna M, Bongiorno D, Buzás E, Ceraulo L, Cooks RG, Diez-Masa C, de Frutos M, Gráf L, Héberger K., Jekő J, Kéki S, Kremmer T, Malorni A, Noto D, Paizs B, Pocsfalvi G, de Puerta A, Somogyi A, Telekes A Korábbi kollégék, diákok Lengyel Á,Lipták M, Lovász Cs, Ludányi K, Marino F, Memboeuf A, Nagy K, Nemes P, Pollreisz F, Schlosser G, Szabó P, Szabó R, Szilágyi Z, Sztáray J, Takáts Z, Vas Gy $ $ $ MTA, OTKA, Medichem, Obekon, FP7 Marie Curie, Center for Biochem. Excellence

Hasonló dokumentumok

Vérplazma fehérjék glikozilációjának vizsgálata

Vérplazma fehérjék glikozilációjának vizsgálata Doktori tézisek Dr. Tóth Eszter Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola Témavezető: Dr. Vékey Károly DSc, osztályvezető Hivatalos bírálók: