Fehérje O-glikoziláció tömegspektrometriás vizsgálata. Darula Zsuzsanna MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont Proteomikai Laboratórium

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Fehérje O-glikoziláció tömegspektrometriás vizsgálata. Darula Zsuzsanna MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont Proteomikai Laboratórium"

Laura Gál
5 évvel ezelőtt
Látták:

1 Fehérje O-glikoiláció tömegspektrometriás visgálata Darula Zsusanna MTA Segedi Biológiai Kutatóköpont Proteomikai Laboratórium

2 Fehérjeanalitika 6-as évektől: 9-es évektől: Edman sekvenálás Tömegspektrometria (ESI, MALDI) (de novo és DNS adatbáisok alapján) Post-translációs módosítások visgálata!

3 Post-translációs módosítások Fosforiláció Sulfatálás Disulfid híd Acetileés Metileés Glikoiláció Ubikvitin Lipid Proteolíis SUMO Serkeet, stabilitás, lokaliáció, aktivitás

4 Extracelluláris glikoiláció Fukó (Fuc) Siálsav (SA) Galaktó(Gal) Mannó (Man) GalNAc GlcNAc O-glikán N-glikán Lumen/extracelluláris citosól C-glikoiláció: Trp + Mannó (1994) O-glikoiláció: Tyr-on is!!! (211) S-glikoiláció: Cys + GlcNAc (216)

5 Mucin-típusú (GalNAca) O-glikán magserkeetek a O Ser / Thr Core 1 a O Ser / Thr Core 3 6 a O Ser / Thr Core 2 6 a O Ser / Thr Core 4 a O Ser / Thr Core 5 6 a O Ser / Thr Core 7 6 a O Ser / Thr Core 6 a3 a O Ser / Thr Core 8 GalNAc Gal GlcNAc

6 Biológiai funkció Általános Fehérje serkeet, oldhatóság, stabilitás Sejt-sejt kommunikáció Sejtadhéió Fehérje / helyspecifikus IgA nefropátia familial tumoral calcinosis (FGF23 hormon) Proprotein konvertá Rák, autoimmun betegségek glikoilációs mintáat megváltoik Felhasnálható a betegség kimutatására?

7 Anderson N L, Anderson N G Mol Cell Proteomics 23;2: by American Society for Biochemistry and Molecular Biology Komplex minták (vérsérum): Dúsítás + LC-MS analíis

8 További nehéségek Dúsítás: kis glikán: módosítatlan peptidekhe hasonló fiiko-kémiai tulajdonságok MS/MS: ütköéses aktiválás: cukor lerepül ECD/ETD: glikán résről limitált információ hatékonyság Automatiált adatkiértékelés megbíhatóság?

9 MS/MS (ütköéses aktiválás, CID HCD) módosítatlan peptid 1661_3 #313 RT: AV: 1 NL: 6.16E5 T: FTMS + c NSI d Full ms @hcd3. [1.-2.] 1 y TPLPPTSAHGNVAEGETKPDPDVTER pr y K b b a 2 b y y 9 y y 22 y 24 y y y 2 y 18 b 2 y 21 y y 15 b INT INT Glikopeptid : peptid sekvencia? glikán (serkeet)? módosítás helye?

10 HS Jacalin4.65 5/ _13 #2279 RT: AV: 1 NL: 2.25E4 T: ITMS + c NSI d w Full ms @cid35. [19.-2.] x _37 #2736 RT: AV: 1 NL: 1.7E4 T: FTMS + c NSI d Full ms @hcd35. [1.-2.] 1 HexNAc a HexHexNAc SA H 2 O SA SAHexHexNAc y 4 y y SAHex y SA y SA y 9 y 1 y 11 -SAHexHexNAc J4J -SAHex y SA peptid Peptid (MW:1549) + HexNAcHexSA CID _37 #2737 RT: AV: 1 NL: 1.16E5 T: ITMS + c NSI d sa Full ms @etd66.67 [5.-2.] x2 x5 x pr pr-sa c 3 c pr-ac c c c c

11 HS Jacalin4.65 5/ _13 #2279 RT: AV: 1 NL: 2.25E4 T: ITMS + c NSI d w Full ms @cid35. [19.-2.] x HexHexNAc SA H 2 O SA -SAHexHexNAc -SAHex SA SAHexHexNAc J4J -SAHex -SA Peptid (MW:1549) + HexNAcHexSA CID 13412_37 #2736 RT: AV: 1 NL: 1.7E4 T: FTMS + c NSI d Full ms @hcd35. [1.-2.] 1 HexNAc a y 4 y y SA y Y _37 #2737 RT: AV: 1 NL: 1.16E5 T: ITMS + c NSI d sa Full ms @etd66.67 [5.-2.] x2 x5 x pr 3+ y 8 y 9 y 1 y 11 y TPPQSQTPGALPAKR + HexNAcHexSA HCD 8 6 pr-sa c 3 c pr-ac c c c c

12 HS Jacalin4.65 5/ _13 #2279 RT: AV: 1 NL: 2.25E4 T: ITMS + c NSI d w Full ms @cid35. [19.-2.] x HexHexNAc SA H 2 O SA -SAHexHexNAc -SAHex SA SAHexHexNAc J4J -SAHex -SA Peptid (MW:1549) + HexNAcHexSA CID 13412_37 #2736 RT: AV: 1 NL: 1.7E4 T: FTMS + c NSI d Full ms @hcd35. [1.-2.] 1 HexNAc SA y _37 #2737 RT: AV: 1 NL: 1.16E5 T: ITMS + c NSI d sa Full ms @etd66.67 [5.-2.] x2 x5 x a 2 c 3 c 5 y 4 pr 3+ y y y 8 pr-sa y 9 y 1 y 11 pr-ac c c c c c y TPPQSQTPGALPAKR peptid + HexNAcHexSA TPPQSQTPGALPAKR l HexNAcHexSA HCD ETD

13 RPLC-MS: HCD és ETD adatok Kiértékelés: adatbáis Sérumfehérjék O-glikoilációs visgálata Dúsítás: lektin affinitás kromatográfia Jacalin (Gal1,3GalNAca) + ERLIC (hidrofilicitás, savasság) + miex + Jacalin Búacsíra agglutinin (WGA) + Jacalin

14 Bitos jó, amit a adatbáis kereső mond? Humán sérum triptikus eméstmény Kétkörös lektin affinitás dúsítás (WGA) Váratlan glikán serkeetek? HexNAcHexFuc??? Peptide RT(min) Score Expect Peptid TFVLS(511.19)ALQPSPTHSSSNTQR Peptid TFVLSALQPS(656.23)PTHSSSNTQR E-5 Peptid TFVLSALQPS(759.29)PTHSSSNTQR HexNAcHexSA???

15 E:\OT_Elite\1389_3 8/9/213 1:28:37 AM WGA double digest pooled 128 exp 5/2 ul 1389_3 #6948 RT: AV: 1 NL: 9.41E4 T: FTMS + c NSI d Full ms @hcd35. [1.-2.] y a 2 b TFVLSALQPSPTHSSSNTQR + HexNAcHexSA b y y y 1 y 17 y 16 y 1 y 11 y 13 y y y y y Y y 12 G _3 #6949 RT: 39.6 AV: 1 NL: 8.87E5 T: ITMS + c NSI d sa Full ms @etd66.67 [5.-2.] x2 x2 x5 x TFVLSALQPSPTHSSSNTQR + HexNAcHexSA (Ser1 Thr12) SA c c -Ac 9 16

16 E:\OT_Elite\1389_3 8/9/213 1:28:37 AM WGA double digest pooled 128 exp 5/2 ul 1389_3 #2371 RT: AV: 1 NL: 1.91E3 T: FTMS + c NSI d Full ms @hcd35. [1.-2.] y y Y y y _3 #2372 RT: AV: 1 NL: 1.13E4 T: ITMS + c NSI d sa Full ms @etd66.67 [5.-2.] x2 x2 x5 x a 2, b 2, b 3??? y c X TFVLSALQPSPTHSSSNTQR + HexNAcHexFuc? y 12 y 13 y 12 NEM TFVLSALQPSPTHSSSNTQR + HexNAcHexFuc, Hanem VLSALQPSPTHSSSNTQR Da glikán??? c G y 18 Peptide RT(min) Score Expect Peptid TFVLS(511.19)ALQPSPTHSSSNTQR Peptid TFVLSALQPS(656.23)PTHSSSNTQR E-5 Peptid TFVLSALQPS(759.29)PTHSSSNTQR Y! X

17 E:\OT_Elite\1389_3 8/9/213 1:28:37 AM WGA double digest pooled 128 exp 5/2 ul 1389_3 #2371 RT: AV: 1 NL: 1.91E3 T: FTMS + c NSI d Full ms @hcd35. [1.-2.] VLSALQPSPTHSSSNTQR Y _3 #6948 RT: AV: 1 NL: 9.41E4 T: FTMS + c NSI d Full ms @hcd35. [1.-2.] A HCD spektrumok meglehetősen hasonlítanak valósínűleg nem a peptid, hanem a GLIKÁN HORDOZZA A MÓDOSÍTÁST _3 #624 RT: 36.7 AV: 1 NL: 1.85E4 T: FTMS + c NSI d Full ms @hcd35. [1.-2.] Y TFVLSALQPSPTHSSSNTQR TFVLSALQPSPTHSSSNTQR Y

18 E:\OT_Elite\1389_3 8/9/213 1:28:37 AM WGA double digest pooled 128 exp 5/2 ul 1389_3 #2372 RT: AV: 1 NL: 1.13E4 T: ITMS + c NSI d sa Full ms @etd66.67 [5.-2.] VLSALQPSPTHSSSNTQR Da _3 #6949 RT: 39.6 AV: 1 NL: 8.87E5 T: ITMS + c NSI d sa Full ms @etd66.67 [5.-2.] TFVLSALQPSPTHSSSNTQR SA Ac _3 #625 RT: 36.8 AV: 1 NL: 4.81E4 T: ITMS + c NSI d sa Full ms @etd66.67 [5.-2.] TFVLSALQPSPTHSSSNTQR Da ~394 Da siálsav-serű módosítás: ~13 Da additív tömeg

19 E:\OT_Elite\1389_3 8/9/213 1:28:37 AM WGA double digest pooled 128 exp 5/2 ul 1389_3 #2371 RT: AV: 1 NL: 1.91E3 T: FTMS + c NSI d Full ms @hcd35. [1.-2.] b _3 #6948 RT: AV: 1 NL: 9.32E4 T: FTMS + c NSI d Full ms @hcd35. [1.-2.] _3 #624 RT: 36.7 AV: 1 NL: 2.14E3 T: FTMS + c NSI d Full ms @hcd35. [1.-2.] 1 b 3 SA a 2 a 2 a 2 b 2 b 2 SA SA + 13 Da b 3 SA + 13 Da

20 Milyen reagenseket hasnáltunk a mintaelőkésítés során? Affinitás kromatográfia Tris pufferben MW: Da rest of sialic acid unit O O C O O Tris ph=7.5 adjacent sugar unit CH 2 OH HOH 2 C rest of sialic acid unit HOH 2 C O O NH C HO O adjacent sugar unit

21 Tanulságok PTM analíis - adatkiértékelő softverek további fejlestésre sorulnak A eredmények manuális validálása egyelőre megkerülhetetlen

22 Kösönetnyilvánítás Dr. Tóth Géa, Dr. Dirk Tourwe MTA SBK Proteomikai Laboratórium Dr. Medihradsky Katalin Hunyadi-Gulyás Éva, Klement Éva Alapítvány a Magyar Peptid- és Fehérjekutatásért Soros Alapítvány Magyar Állami Eötvös Östöndíj MTA Bolyai János Kutatási Östöndíj OTKA

Hasonló dokumentumok

A Proteomika Szolgáltató Laboratóriumban elérhető szolgáltatások

A Proteomika Szolgáltató Laboratóriumban elérhető szolgáltatások Dr. Csősz Éva Proteomika Szolgáltató Laboratórium műszerpark MALDI-TOF (ABSciex) PSZL ESI-4000 QTRAP (ABSciex) Kétdimenziós elektroforézis