Szuperkritikus fluid kromatográfia (SFC)

Átírás

1 Szuperkritikus fluid kromatográfia (SFC) Fekete Jenő, Bobály Balázs Az elválasztástechnika korszerű módszerei

2 Az alapok hasonlítanak a folyadékkromatográfiához - Lineáris, elúciós kromatográfia, mozgófázis, állófázis, hatékonyság, nyomásesés, követelmények, készülékfelépítés, stb - Lényeges különbség: mozgófázis szuperkritikus/szubkritikus állapotban van - Eltérések az anyagátadásban (mozgó- és állófázis közt) - Eltérések a készülék felépítésben

3 SFC jelentősége, helye a kromatográfiás módszerek GC Előnyök: univerzális, érzékenyen, gyors FID detektor Nagy kinetikai hatékonyság Hátrányok: hőérzékeny vegyületek mérése ionos/nagy molekulatömegű vegyületek mérése GC FID között LC Előnyök: hőérzékeny vegyületek mérése ionos/nagy molekulatömegű vegyületek mérése Hátrányok: Nincs általános, nagy érzékenységű detektor Kisebb kinetikai hatékonyság LC egyéb SFC mozgófázis jellege: gáz és folyadék között nagy hatékonyság hőérzékeny anyagok vizsgálata: nem csoda módszer: ld. később

4 One of the most interesting features of ultra high pressure gas chromatography would be convergence with classical liquid chromatography Giddings, 1965

5 Szuper/szubkritikus állapot GÁZ FOLYADÉ K SZUPER KRITIKUS

6 Szuper/szubkritikus állapot Paraméter gáz szuperkritikus fluid folyadék diffúzi ziós s koefficiens [cm 2 /sec] sűrűség g [g/cm 3 ] ,3 0,8 1 viszkozitás s [poise] Szuper állapot: -Folyadékhoz hasonló sűrűség (jó oldóképesség) -Gázhoz hasonló viszkozitás (diffúzivitás, kis áramlási ellenállás) -Diffúzivitás: gáz-folyadék között (hatékony anyagátadás, C-tag kisebb)

7 Mozgófázis Túlnyomó többségben CO 2 a mozgófázis: Kedvező kritikus értékek Hozzáférhetőség Ár és biztonság

8 Mozgófázis -CO 2 (apoláris, hexánhoz hasonló, alacsony T c /P c, nem mérgező, olcsó ) + DKM, MeOH, MeCN, ipr-oh, THF (poláris módosítók), ált. 2-40% -Növelik a mozgófázis eluenserősségét -Változtatják a szelektivitást -Növelik a minta oldhatóságát + Savak: hangyasav, TFA (0,1%) Bázisok: NH 4 OH, alifás aminok, pl. dietil-amin (0,1%) Szabad savas szilanol csoportok maszkírozása de: ph-t nehéz definiálni Állófázis -Polárisan módosított szilika, vagy szilika (NP-LC) -Apolárisan módosított szilika (RP-LC, NARP-LC) Királis állófázisok (pl. szénhidrát alapú) Mintaoldószer -általában n-c 7, poláris módosító lehet

9 Szubkritikus állapot CO 2 -MeOH elegy kritikus pontjai - Dolgozhatunk a szubkritikus tartományban is, de az elválasztás során lehetőleg ne történjen állapotváltozás!

10 Vizsgálható vegyületek - Oldható a mozgófázisban - kémiai átalakulás nélkül -a detektálás megszabta koncentrációnak megfelelően -Apoláris karakterű anyagok (aril, alkil, stb.), amelyek tartalmazhatnak poláris csoportokat (-OH, -COOH, -NH 2, -CN, stb.) -Nem vizsgálható: ionos vegyületek és fehérjék Ezek kicsapódnak a mozgófázisból

11 Leginkább a NP-LC-hoz hasonlítható, alkalmazható annak kiváltására Miért jó ez? -NP-LC-ben erős, H-hidas kölcsönhatások dominálnak Lassú az anyagátadás Széles csúcsok, kis hatékonyság Modern SFC: UHPSFC -kis viszkozitású mozgófázis: gyors anyagátadás, kis nyomásesés -2µm alatti porózus, vagy héjszerű töltetek -Max ~400 bar -UHPLC hatékonyság, rövidebb mérési idő -Preparatív kromatográfiás előnyök-könnyű az anyag kinyerése a frakciókból!

12 Stokes Einstein: 2 nagyságrenddel kisebb a fluidum viszkozitása szuperkritikus állapotban! A C tag extrém kicsi lesz!

13 UHPLC 3.5 µm UHPSFC 3.5 µm UHPLC 1.7 µm UHPSFC 1.7 µm UHPSFC közel azonos hatékonyság (UHPLC) nagyságrendekkel kisebb nyomásesés hatékonyabb anyagátadás többszörösével csökkent mérési idő de a mozgófázis sűrűsége (oldóképessége) erősen nyomásfüggő. Nagyobb nyomás kisebb visszatartást jelent! Optimálás? ~4x

14 Visszatartás nyomásfüggése (1bar 14.5psi)

15 Hatékonyság növekedése N = L H = L h d p C = f d D 2 p m u opt = v opt d D p m HPLC SFC H (µm) UHPLC UHPSFC u (mm/s)

16 NP-LC vs UHPSFC Enantiomerek elválasztása (normál fázisú királis LC) r/s sotolon 28 min mérési idő 1.8 min mérési idő

17 RP-LC vs UHPSFC Szteroidok elválasztása UHPSFC UHPLC Itt is érvényesek az UHPLC szabályai: kis kolonnán kívüli térfogat (V EC ~σ EC ) kis gradiens késleltetési térfogat kis mintatérfogat (mintaoldószer!) kis kolonnák érzékenyebben reagálnak a kolonnán kívüli térfogatra és V inj ra 2 σ col H r = 100 σ + σ 2 col 2 ext UHPLC: 50*2.1 mm min! UHPSFC: 100*3 mm min!

18 A kolonna elején n elért B%, amennyiben eltérő késleltetési si térfogatú (dwell volume) keverővel vel ellátott gradiens készülékkel dolgozunk. Nagy térfogatt rfogatú késleltetési si térfogattal t NINCS UHPSFC B% 100 t g t [perc]

19 Gradiens késleltetés Nagynyomású szivattyúk Kolonnán n kívüli k térfogatt Mintaadagoló Összekötő vezeték Eluenstartály Keverő Kolonna Kolonna térfogatt Detektor Adatgyűjtés SFC UHPLC UHPSFC Gradiens késleltetési térfogat (V D ) 2270 µl 90 µl 440 µl Gradiens késleltetési idő 68 sec (F = 2.0 ml/min) 15 sec (F = 0.36 ml/min) 12 sec (F = 2.4 ml/min) Kolonnán kívüli térfogat (V ext ) 118 µl 13 µl 60 µl Alkalmazható kolonna dimenziók 150 x 4.6 mm (volume ~ 1750 µl) 50 x 2.1 mm (volume ~ 120 µl) 100 x 3.0 mm (volume ~ 460 µl)

20 Kolonnán kívüli zónaszélesedés Nagynyomású szivattyúk Kolonnán n kívüli k térfogatt Összekötő vezeték Mintaadagoló Eluenstartály Keverő Kolonna Kolonna térfogatt Detektor Adatgyűjtés ~ 85 µl 2 σ + σ = σ 2 col 2 ext 2 total σ 2 col = col ( V ( 1 k) ) V 2 r 0 = + N N col 2 σ 2 ext = V inj Vcell 2 2 rc lc F Kinj + Kcell + τ F Dm Mintaadagoló Detektor Összekötő vezetékek

21 A készülék felépítése (UPC 2 ) különbségek egy UHPLC rendszerhez képest Hűtött pumpafej a CO 2 szállítására Injektálás kiegészítő forgószelepen keresztül Aktív előmelegítés (opcionális UHPLC ben) Nyomásszabályozás az UV/DAD detektor után, CO 2 kezelése

22 Hűtött pumpafej a CO 2 szállítására A pumpa folyékony CO 2 ot szállít (merülőcsöves élelmiszeripari minőségű ($) CO 2 ) a nyomás állandó értéke automatikus összenyomhatósági kompenzációval valósul meg a pumpa termosztált, így a nyomás és hőmérséklet jól kontrollált, a mozgófázis sűrűsége konstans és az áramlási sebesség állandó

23 Injektálás kiegészítő forgószelepen keresztül Minta betöltése (load) Injektálás (inject) LC: nincs fáziskülönbség a minta és a mozgófázis között töltés alatt a mozgófázis nem jut a mintahurokba (nem diffundál bele) Minta betöltése (load) 1 2 Injektálás (inject) SFC: van fáziskülönbség a minta és a mozgófázis között töltés alatt (néhány sec) a mozgófázis bediffundálhatna a mintahurokba (reprodukálhatóság csökkenése) A segédszelep (1) töltés alatt atm. nyomáson tartja a 2 es szelepet Injektálás: először a 2 es, majd az 1 es szelep fordul

24 Aktív előfűtés a szuper/szubkritikus állapot eléréséhez

25 Optikai detektor utáni nyomásszabályozás A detektorcellában nincs dekompresszió, így fázisátalakulás A nyomás állandó értéken tartható a mérés során, vagy fix háttérnyomás állítható be Fűtött modul: kompenzálja a dekompresszió során fellépő hőmérséklet csökkenést megakadályozza a szilárd anyag kiválását MS kapcsolás: - make up oldószer adagolása az optikai cella után (vizes-szerves, ionizációt segítő puffer) -Hatékonyság romlás a CO 2 dekompressziója miatt szer jobb MS érzékenység UHPLC-hez viszonyítva (könnyebb deszolvatáció)

26 UHPSFC előnyök UHPSFC hátrányok Zöldebb: a CO 2 a levegőből kinyerhető oda is jut vissza (a hexán nem) Nem igényel nagy eluensmennyiséget: ~1 palack CO 2 /hónap (kb. 20e Ft) Gyors mérési módszer Nagyon hatékony királis elválasztásokban (1/10 mérési idő vs. NP LC) Nagyon hatékony preparatív feladatokban (egyszerű izolálás: dekompresszió, esetleg minimális bepárlás) Zöldebb: a CO 2 a levegőből kinyerhető oda is jut vissza biztonsági kockázat Nem igényel nagy eluensmennyiséget: ~1 palack CO 2 /hónap (kb. 20e Ft) + szerves osz. Gyors mérési módszer, UHPLC is tudja Műszer bekerülési költsége relatíve magas (UHPSFC: ~30M, UHPLC: ~20M) Új paraméterek a módszerfejlesztésben (P) Kevesebb tapasztalat Jövő: akceptálja e a technológiát a gyógyszeripar? UHPSFC inkább normál fázis kiváltására célszerű, az LC mérések 80 90% pedig RP Királis elválasztásokban nagyon nagy hatékonyság és sebbesség Igen: $ fejlesztésre, tapasztalat, rutin technika Nem: nincs fejlesztés, kutató készülék