Tömegspektrometria. Mintaelőkészítés, Kapcsolt technikák OKLA 2017

Átírás

1 Tömegspektrometria Mintaelőkészítés, Kapcsolt technikák OKLA 2017

2 Mintabeviteli rendszer Működési elv Vákuumrendszer Ionforrás Tömeganalizátor Detektor Electron impact (EI) Chemical ionization (CI) Atmospheric pressure (API) Electrospray (ESI) Matrix assisted laser Desorption/ionization (MALDI) Surface enhanced LDI (SELDI) Fast atom bombardment (FAB) Electrostatic (ESA) Magnet (B) Time-of-flight (TOF) Quadrupole (Q) Ion Traps (2D, 3D IT) Ion-Cyclotron Resonance (ICR) Orbitrap (OT) Adatfeldolgozás

3 Ionizációs módszerek Electron impact (EI) Chemical ionization (CI) Atmospheric pressure (API) Electrospray (ESI) Matrix assisted laser desorption/ionization (MALDI) Direct analysis in real time (DART)

4 Ionforrások Electrospray Ionization MALDI APPI APCI DART 10 Nonpolar Polarity Very polar

5 Tömeganalizátorok Magnet (B) Time-of-flight (TOF) Quadrupole (Q) Ion Traps (2D, 3D IT) Ion-Cyclotron Resonance (ICR) Orbitrap (OT)

6 Miért van szükség mintaelőkészítésre? Az analitok számos különböző mátrixban lehetnek Extrakció (kinyerés) Tisztítás

7 Mintaelőkészítés nélkül

8 Zavaró hatás pl. Ion supression A zavaró vegyületek csökkenthetik az analit ionizációját és a módszer érzékenységét Versengés az ionforrásban Nagy koncentrációjú szennyezők elnyomhatják az analit jelét

9 Hogyan kezdjünk hozzá? Milyen műszerünk van? Ionizációs módszer? Minőségi/mennyiségi meghatározás Érzékenység/koncentráció Analízis idő Mintaelőkészítés, derivatizáció Minél rövidebb annál jobb

10 Mintaelőkészítés Az analit elválasztása a zavaró mátrixtól Pl: metabolitok meghatározása vérből zavaró fehérjék eltávolítása szükséges Extrakció, szűrés a sótartalom eltávolításához Kapcsolt elválasztástechika (GC, LC) Analit koncentrációjának növelése Pl: növényvédő szerek kimutatása ivóvízből kinyerés, bepárlás szükséges Derivatizáció (egyszerű, gyors legyen) Növelhető a vegyületek illékonysága GC

11 Solid Phase Extraction (SPE) Kromatográfiás elven működik Töltött kolonnák Jól megalapozott technológia Számos irodalmi referencia Tiszta extraktum Jó visszanyerés poláris vegyületeknél A mintát folyadékfázisba kell hozni Gravitációs, nyomás vagy vákuum segített megoldások Automatizálható

12 Elválasztástechnikák Módszer Folyadék-folyadék extrakció Elválasztás alapja Megoszlás a két fázis között Eszközök Üvegeszközök Szilárd fázisú Adszorbció/ Oszlopok extrakció megoszlás Szűrés/ ultraszűrés Desztilláció vagy bepárlás Csapadékképzés Molekulatömeg/ méret Forráspont/ gőznyomás Oldhatóság

13 Tisztítás

14 Csapadékképzés Fehérjék kinyerése vagy eltávolítása Pl. Acetonnal: Aceton hozzáadása a fehérje oldathoz Inkubálás: -20 C éjszakán át, szárazjégen 2-3 h Centrifugálás (-4 C, 10 perc), felülúszó eltávolítása Mosás 100% acetonnal (-20 C) Bepárlás vákuummal, tárolás -20 C-on

15 Műszeres elválasztástechnikák Módszer Elválasztás alapja Eszközök További lépések Gél elektroforézis (1D) Molekulatömeg Gél, feszültség Fehérjék in-gél Gél elektroforézis (2D) Izoelektromos pont Gél, feszültség, emésztése és molekula tömeg amfolit peptidekké Fordított Kapilláris fázisú elektroforézis Hidrofób kölcsönhatás, HPLC CE Fehérjék kromatográfia kölcsönhatás molekulatömeg, és emésztése izoelektromos pont molekulatömeg peptiekké Méretkizárásos Fordított fázisú Molekulatömeg Hidrofób HPLC Fehérjék kromatográfia kölcsönhatás és emésztése Ioncserés Kation molekulatömeg vagy anion HPLC peptiekké Méretkizárásos kromatográfia affinitás Molekulatömeg HPLC Gázkromatográfia GC Online MSMS Ioncserés Kation vagy anion HPLC kromatográfia affinitás Gázkromatográfia GC Online MSMS

16 Kapilláris elektroforézis Atmoszférikus nyomású ionforrások Bonyolult kapcsolás

17 Kapilláris elektroforézis- MS kapcsolásának problémái Alkalmazott feszültségek különbözőek ~10-30kV vs ~3kV CE esetében a folyadékáram alacsony (nl) nano ESI segédáram CE mérésekhez puffer szükséges Csak gyors pásztázású analizátorok használhatóak Kapcsolt technikánál az egyik puffer edényt egy MS-re cseréljük

18 Kromatográfiás oszlop (kolonna) Normál fázisú, fordított fázisú (szilika, C8, C18)

19 LC és MS összekapcsolása, megoldandó problémák LC-ből kilépő folyadék légköri nyomású, viszonylag alacsony hőmérsékletű MS-hez adott esetben vákuum és magasabb hőmérséklet szükséges Molekulatömeg korlátok Pufferek használata

20 LC és MS összekapcsolása Áramlási sebesség és ionforrás 1 ml/min APCI (nagyobb hőm., és gázáram) 0.1 ml/min ESI (splitter)

21 Kerülendő szennyezések Só és puffer koncentráció <10 mm Csúcsszélesedést, kisebb ionizációs hatásfokot okozhat Víz és Acetonitril (100% ACN nem) preferált oldószerek Minta tárolása kisüvegekben, műanyag helyett Felületaktív anyagok, glicerin eltávolítása!

22 Proteomika LC-MS/MS

23 Méretkizárásos kromatográfia

24 Ioncserés kromatográfia

25 Gázkromatográfia Illékony vegyületek (származékképzés) Interfész köti össze a kolonnát az ionforrással. EI, CI ionizáció (cold EI) Gáz áramlási sebessége

26 GCMS kromatogram és spektrum

27

28 Szacharóz TMS származéka C 36 H 86 O 11 Si 8 (MW = 918 m/z)

29 Kapcsolás nehézségei ICP-MS Reakció és ütközési cella Alkalmazott analizátorok Kimutatási határok Spektrális zavarás ( 40 Ar, 40 Ca; 52 Cr, 35 Cl 16 O 1 H) ICP-OES GFAAS ICP-MS

30 ICP-MS

31 Validálás Ismételhetőség (Repeatability) A módszer válaszjelének szórása azonos körülmények között Szelektivitás (Selectivity) Egyéb komponens zavaró hatásának kizárására jellemző kvalitatív fogalom Linearitás (Linearity) Koncentráció- válaszjel függvénykapcsolat meghatározása, szigorúan csak egy adott tartományra érvényes

32 Validálás Detektálási határ (LOD) Meghatározási határ (LOQ) σ S a tengelymetszetek szórása a meredekségek átlaga 3,3σ LOD = S 10σσ LOQ = S Sok-sok egyéb módszer

33 Validálás Szórás, precizitás (Precision) Azonos mintára kapott válaszjel szórása (nem standard mintára, hanem valós mintára vonatkoztatva Helyesség (Accuracy) Milyen közel van az eredmény a valóshoz Visszanyerés (Recovery) Ismert mennyiség adagolásával minta mennyiségének nyomon követése az előkészítás során Stabilitás vizsgálat (Stability) A minta stabilitásának meghatározása, mennyi ideig marad a minta minta

34 Köszönöm a figyelmet!