Tömegspektrometriás módszerek a klinikai kémiában

Átírás

1 Tömegspektrometriás módszerek a klinikai kémiában Szabó Eszter, Takáts Zoltán I. számú Gyermekgyógyászati Klinika, Anyagcsere Laboratórium

2 Intenzitás SEMMELWEIS UNIVERSITY, BUDAPEST Tömegspektrometria Mi az? Ionizáció Molekulák a kondenzált fázisban Töltés Tömeg Tömeganalízis Gázfázisú ionok Gázfázisú ionok Tömeg / töltés

3 Pozitív vagy negatív ionizáció? Pozitív ion detektálás Ha a mintának van olyan funkciós csoportja, amely kész protont felvenni (H ) pl. aminok R-NH 2 H = R-NH 3 FEHÉRJÉK vagy PEPTIDEK Negatív ion detektálás Ha a mintának van olyan funkciós csoportja, amely kész protont leadni pl. karbonsavak R-CO 2 H = R-CO 2 - alkoholok R-OH = R-O - SZACHARIDOK vagy OLIGONUKLEOTIDOK

4 Intenzitás SEMMELWEIS UNIVERSITY, BUDAPEST A tömegspektrum Egyszeres töltésű molekulaionok Kétszeres töltésű molekulaion Egyszeres töltésű adduktion Koncentráció! Izotópcsúcs Molekulatömeg! Tömeg / töltés

5 Tandem tömegspektrometria Első tömeganalízis Fragmentáció Második tömeganalízis A fragmentáció során keletkezett fragmens ionok m/z eloszlása szerkezeti információt hordoz, valamint alkalmas a vegyületek azonosítására is. Molekulaszerkezet felderítése Kvalitatív ill. kvantitatív analitika

6 Tömegspektrometria felhasználási területei Szerkezetkutatás általános szerkezetmeghatározás metabolit vizsgálatok fehérjeszekvenálás fehérjék poszttranszlációs módosításainak meghatározása Analitika Nyomnyi mennyiségben jelen levő szerves vegyületek meghatározása gyógyszerszint meghatározás anyagcseretermékek szintjének meghatározása toxikológiai alkalmazások

7 Tömegspektrometriásan vizsgálható minták SEMMELWEIS UNIVERSITY, BUDAPEST Minta elpárologtatás extrakció oldószercsere szűrés gázkromatográfia származékképzés folyadékkromatográfia elektroforézis... MS A tömegspektrometriában általában a mintaelőlészítés a szűk keresztmetszet Ha ezt tágítjuk, tágul az alkalmazhatóság köre A mintaelőkészítési eljárások minden esetben invazívak

8 Tömespektrométer Ionforrás Analizátor Detektor

9 Ionizációs módszerek I. Hagyományos technikák Vákuumban történő ionizáció Gázhalmazállapotú minta GC csatolás Elektronütköztetéses ionizáció M ionok Fragmentáció Spektrumtár alapján kvalitativ analizis lehetősége Kémiai ionizáció Csak molekulaion Molekulatömeg megállapitás MS/MS segitségével szerkezeti információ Deszorpciós technikák Kondenzált fázisú minták ionizációja Nem igényli a minták elpárologtatását Nincs keresztszennyezés! SIMS Nagy sebességű primer ionsugár Jó térbeli felbontás Gyenge érzékenység MALDI Lézer Felület ún. mátrixvegyülettel boritott Gyengébb térbeli felbontás

10 Hagyományos Ionizációs technikák 1. Elpárologtatás 2. Ionizáció Elektronütköztetés elektron 70 ev Fragmentáció Csak illékony molekulák Fragmentációs mintázatból azonosítás Nem illékony molekulák csak származékként, de MW < 1000!!!!

11 GC-MS Gázkromatográfia MS detektálással Származékképzés nélkül csak illékony és termikusan stabil anyagok Származékképzés után bármilyen kis molekula EI/CI ionizáció Nagyon jó elválasztás Alkalmazási területek Környezetanalitika Élelmiszeranalitika Lipidomika (származékképzéssel) Diagnosztika Abszolút érzékenység : fg pg tartomány Lineáris tartomány akár 5 nagyságrend EI spektrumok kvalitativ analízis lehetősége Általában bonyolult mintaelőkészítést igényel Csak illékony komponensek lehetnek a mintában Származékképzés Kromatográfia Kapilláris GC, 0,1-0,25 mm ID oszlopok

12 Ionizációs technikák Modern technikák Mátrix segített lézer deszorpciós ionizáció (MALDI) lézer Tetszőleges molekuláris komponens vizsgálható (vízmolekula, egész vírus) Nem kvantitatív Elsősorban kvalitatív, proteomikai analízis

13 MALDI-MS Matrix assisted laser desorption ionization Általában UV lézer, néha IR Mátrix általában aromás karbonsav Mintákat oldatfázisban keverjük el 1000 X X mátrixfelesleggel Tetszőleges, a mátrix tömegénél nehezebb molekula vizsgálható Elsősorban bottom-up proteomika Nem kvantitatív Érzékenység fg pg tarományban Mintaelőkészítés automatizálható - High throughput analitics Egyéb alkalmazási területek: Intakt fehérje vizsgálat Oligoszacharid és glikopeptid vizsgálatok Oligonukleotid analízis (High throughput SNP detektálás) Kémiai képalkotás (imaging) Polimer analitika

14 Ionizációs módszerek II. Spray technikák Atmoszferikus nyomású ionizáció Folyadékhalmazállapotú minta LC csatolás Electrospray ionizáció Vezetőképes folyadék elektrosztatikus porlasztása Molekulaionok v. Komplexek Többszörösen töltött ionok Csak oldatban eleve ionként előforduló specieszek Sonic spray Pneumatikus porlasztás Erőteljes komplexképződés Gyenge érzékenység Atmoszferikus nyomású kémiai ionizáció Pneumatikus porlasztás Korona kisülés Spektrálisan hasonló a kémiai ionizációhoz Mérsékelten poláros, termikusan stabil vegyületek Egyéb technikák Atmoszferikus nyomású fotoionizáció Térdeszorpciós ionizáció Direkt ionizációs technikák DESI DART JeDI ASAP

15 Elektrospray ionizáció (ESI) Electrospray tű Csepp kialakulás Coulomb hasadás Oldószer párolgása Ion evaporáció

16 LC-MS HPLC elválasztás MS detektálással ESI vagy APCI ionizáció Általában kis molekulák (MW<5 kda) kvantitatív meghatározása Gyógyszeranalitika ADME TDM Proteomika Metabolomika Érzékenység : LLOQ ~ 1-10 pg általában Mintaelőkészítés SPE Oldószeres extrakció Kromatográfia: RP-HPLC (ESI, APCI) (NP-HPLC (APCI)) CE

17 Tömeganalizátorok SEMMELWEIS UNIVERSITY, BUDAPEST 3D Ion trap

18 Mágneses szektor analizátor B m 46 m 45 m 44 m/z = (eb 2 r 2 )/(2U) Mágnes E Gyorsítás Ionforrás ionforrás detektor

19 Repülési idő analizátor (TOF) Jellemzői: m/z tartomány: nincs felső határ Felbontás: ~ Tömegpontosság: ~ 3-10 ppm Szkennelés sebessége: 10 6 u/s Vákuum: 10-7 Torr Kvantitatív meghatározás: gyenge, közepes Pozitív és negatív mód Variációk: Lineáris, Reflectron, Tandem MS (Q, TOFs) 1 mv 2 eu 2

20 Quadrupole analizátor (Q) SEMMELWEIS UNIVERSITY, BUDAPEST Jellemzői: m/z tartomány: u Felbontás: egység Tömegpontosság: ~ /- 0.1 u Szkennelés sebessége: 4000 u/s Vákuum: Torr Kvantitatív meghatározás: jó Pozitív és negatív mód Variációk: SingleQ, TripleQ

21 3D Ion csapdás analizátor SEMMELWEIS UNIVERSITY, BUDAPEST Jellemzői: m/z tartomány: u Felbontás: egység Tömegpontosság: ~ /- 0.1 u Szkennelés sebessége: 4000 u/s Vákuum: 10-3 Torr Kvantitatív meghatározás: lehetséges, nem pontos Pozitív és negatív mód

22 Fourier transzformációs ion ciklotron rezonancia analizátor Jellemzői: m/z tartomány: >15000 u Felbontás: nagy, 10 6 Tömegpontosság: ~ 100 ppb Szkennelés sebessége: gyors Vákuum: Torr Kvantitatív meghatározás: lehetséges, nem pontos Pozitív és negatív mód csapdázó elektród gerjesztő elektród detektáló elektród detektáló elektród gerjesztő elektród csapdázó elektród

23 Triple Quadrupole (QQQ)

24 Q-TOF SEMMELWEIS UNIVERSITY, BUDAPEST

25 Kvantitatív meghatározások Külső kalibráció Hígítási sor az analitból, az eredeti mátrixban A mintákkal azonos mintaelőkészítés Belső standard Kémiailag hasonló vegyület, ideálisan stabil izotóp ( 2 H, 13 C, 15 N, etc.) jelzett originális vegyület Tömegspektrométer képes szelektíven detektálni a nehéz izotóppal jelzett iont Kvantitatív meghatározásoknál mindig külső kalibráció belső standard

26 Tömegspektrometria klinikai kémiai alkalmazásai Gyógyszer-szintmérés Toxikológia Metabolikus komponensek meghatározása Hormonok, egyéb jelátviteli komponensek meghatározása Fehérjék azonosítása Fehérjék funkcionális és szerkezeti jellemzése

27 Gyógyszerszintmérés Gyógyszermolekulák mennyiségi meghatározása Szérum, vizelet, teljes vér, liquor Szűk terápiás tartomány < 1 nagyságrend Gyors metabolizmus Nagy egyéni variancia Személyreszabott orvoslás (Personalized medicine) Immunszuppresszánsok Sirolimus, Tacrolimus, Cyclosporin A Rejekció Fertőzés Tirozin kináz inhibitorok Imatinib, Dasatinib, Gefitinib Nagy dózis potenciális vese és májkárosodás

28 Gyógyszerszintmérés - módszertan Mintaelőkészítés Fehérjementesítés Kicsapás acetonitrillel, triklór ecetsavval, etc. Ultraszűrés 3 kda-os szűrővel SPE Lipidmentesítés (csak teljes vér esetén) Extrakció kloroformmal SPE fordított fázison Extrakció Gyakran együtt a fehérje- ill. lipidmentesítéssel Oldószeres extrakció Szilárd fázisú extrakció (fordított fázis vagy ioncsere) Oldószercsere Minta a HPLC módszernek megfelelő oldószerben kell legyen (összetétel, ph)

29 Gyógyszerszintmérés módszertan Gázkromatográfia tömegspektrometria Illékony vagy könnyen illékonnyá tehető gyógyszermolekulák esetén Egyes szteroidok, lipid jellegű komponensek Ritka alkalmazás, inkább doppinganalitika HPLC tömegspektrometria Általánosságban használt Lényegében bármilyen gyógyszermolekula esetében

30 Gyógyszerszintmérés - módszertan HPLC tömegspektrometria Általában fordított fázisú HPLC Oktadecil-szilika, oktil-szilika Gyógyszermolekulák általában alacsony polaritásúak Gradiens elúció 5% szerves oldószer - 95% szerves oldószer Metanol / víz, acetoniril / víz Illékony puffer, pl. ammónium acetát Gradiens végig kell menjen! (reziduális lipidek)

31 Metabolikus komponensek meghatározása Anyagcsere diagnosztika Veleszületett anyagcserebetegségek diagnosztikája Máj, ill. vesefunkció vizsgálata Kvantitatív vizsgálatok Kromatográfiával kapcsolt tömegspektrometria Általában célzott vizsgálat, pl. aminosavak meghatározása Szemi-kvantitatív vizsgálatok Közvetlen tandem tömegspektrometria Általában szűrővizsgálatok, vagy szűrővizsgálatok megerősítő vizsgálatai

32 In te n s ity, c p s In te n s ity, c p s aminosav profil NL (102.00): Exp 2, to min from Sample 90 (Sample279) of DataSET4.wiff (Turbo Spray) 8.4e4 8.0e4 7.5e4 7.0e4 6.5e4 6.0e4 5.5e4 5.0e4 4.5e4 4.0e4 3.5e4 3.0e4 2.5e4 2.0e4 1.5e4 1.0e acilkarnitin profil Tandem tömegspektrometriás vizsgálatok Max. 8.4e4 cps m/z, amu Prec (85.00): Exp 1, to min from Sample 90 (Sample279) of DataSET4.wiff (Turbo Spray) 2.1e4 2.0e4 1.9e4 1.8e4 1.7e4 1.6e4 1.5e4 1.4e4 1.3e4 1.2e4 1.1e4 1.0e Max. 2.1e4 cps m/z, amu aminosav anyagcserezavarok fenilketonuria jávorfaszörp betegség (MSUD) tirozinémia I és II argininoszukcinát szintáz és liáz hiány homocisztinuria zsírsav oxidáció rövid szénláncú (SCAD) közép szénláncú(mcad) hosszú szénláncú hidroxiacil(lchad) nagyon hosszú szénláncú (VLCAD) többszörös (MADD vagy GAII) karnitin palmitoil transzferáz hiány I és II (CPT-I és CPT-II) karnitin transzport zavara (CT) nonketotikus hiperglicinémia ureaciklus zavarok mitokondriális defektusok 32 SEMMELWEIS UNIVERSITY, BUDAPEST organikus aciduriák b-ketotioláz hiány glutársav acidémia (GA-I) izovaleriánsav acidémia (IVA) metilmalonsav acidémia (MMA) propionsav acidémia (PA) 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA liáz hiány (HMG) 3-metil-krotonil-CoA karboxiláz hiány (MCC)

33 GC-MS módszerek 33 SEMMELWEIS UNIVERSITY, BUDAPEST A b u n d a n c e T IC : N a g y B o g la rk a.d \ d a ta.m s mitokondriális defektusok zsírsav oxidáció aminosav anyagcsere zavarok peroxiszomális defektusok ureaciklus zavarok T im e --> trikarbonsav ciklus szteroid és koleszterin szintézis zavarok

34 34 SEMMELWEIS UNIVERSITY, BUDAPEST HPLC-MS módszerek Acil-karnitin kromatográfia Szérum vagy alvadásgátolt teljes vér Pentafluoro-phenacyl származékképzés Elválasztás fordított fázisú HPLC-vel, detektálás ESI-MS/MS módszerrel ~ 80 acil-karnitin kvantitatív mghatározása Aminosav kromatográfia Szérum, vizelet vagy liquor Ioncsere alapú extrakció, majd alkilálás Elválasztás fordított fázisú HPLC-vel, detektálás pozitív ion ESI-MS/MS módszerrel 24 aminosav kvantitatív meghatározása Cisztein és homocisztein meghatározása (szabad SH tart. AA) Szérum, vizelet vagy liquor Minta redukciója DTT-vel vagy TCEP-pel Elválasztás cianopropil oszlopon, detektálás pozitiv ion ESI-vel Kvantitativ meghatározási módszer

35 Fehérjék tömegspektrometriás vizsgálata Azonosítás Emésztés tripszinnel (Tripszin Arg és Lys után vág, tehát minden keletkező peptid tartalmaz legalább egy protonálható aminosavat) Triptikus peptidek MS és MS/MS vizsgálata Adatbázis keresés Szekvencia meghatározás Átfedő peptidfragmensek szekvenálása MS/MS módszerrel Genetikai információ felhasználása (ti. részleges aminosav szekvenciához tartozó DNS szekvencia keresése) Poszt Transzlációs Módosítások Foszforiláció, glikoziláció, etc. Ismert aminosav szekvenciájú peptidek MS és MS/MS vizsgálata Enzim assay Szubsztráttal történő inkubálás Szubsztrát vagy termék visszamérése LC-MS módszerrel

36 Kémiai képalkotás MS módszerrel Deszorpciós ionizációs technikák MALDI SIMS DeszorpciósESI Mikroszkópos metszetek vizsgálata Pixelenként veszünk fel spektrumot Pixel élhossza 5-50 m Elsősorban biomarker kutatás Lipid jellegű markerek Eicosanoidok Foszfolipidek Fehérjék, peptidek

37 Natív, illetve in-vivo vizsgálatok Probléma a műtét közbeni szövetazonosítás MS analízis szövetspekcifikus adatot szolgáltat Melyik módszer? SIMS Nagyvákuum MALDI Mátrix, lézer, geometria IR talán DESI Magas feszültség, gázáram nem kompatibilis JeDI Vízsugárvágás szórhatja a tumorsejteket

38 Sebészeti eszközök, mint ionforrás Diatermia Műszeres sebészeti eszközök Diatermia Lézersebészet CUSA (Vízsugárvágás) Ion források! Sebészeti CO 2 laser Vízsugár CUSA dissectron

39 Módszerek: Rapid Evaporative Ionization Mass Spectrometry (REIMS) Nitrogen flow Venturi air jet pump Heated capillary Tube lens Skimmer Diatermia mint ionforrás Teflon tubing p=1.5 Torr Needle cutting electrode p= Torr Szövetek gyors elpárologtatásakor keletkező aeroszol tömegspektrometriás analízisre alkalmas Sejtek és szövetek specifikus lipidtartalmát használják ki Tissue

40 Adatkiértékelés Főkomponens analízis (Principal Component Analysis, PCA) dimenziócsökkentésre és lineáris diszkriminancia analízis (LDA) az osztályozáshoz

41 Köszönöm a figyelmet!