Tömegspektrometria. Talián Csaba Gábor PTE Biofizikai Intézet

Átírás

1 Tömegspektrometria Talián Csaba Gábor PTE Biofizikai Intézet

2 Alapelvek Ionok képzése bármely alkalmas anyagból Ionok szétválasztása m/z alapján Ionok minőségi és mennyiségi detektálása az m/z gyakoriság függvény szerint tömegspektrum

3 Miért jó? Nagy érzékenység kvalitatív kimutathatósági tartomány: g kvantitatív kimutathatósági tartomány: g Széles tömegtartomány relatív tömegegység Mért érték specifitása és reprodukálhatósága Alacsony mintaigény µg pg

4

5 Felépítés Adatfeldolgozás, vezérlés mintabevitel ionforrás analizátor detektor Vákuumrendszer

6 Vákuum mbar Diffúziós olajpumpa és turbomolekuláris pumpa Ionizációs hatásfok, érzékenység és felbontás növelése Részecske-ütközések elkerülése Módosítják az ionok röppályáját, kinetikus energiáját Kioltják az ionok töltését Fragmentálják az ionokat más tömeg

7 Mintabevitel Bármilyen halmazállapotú minta vizsgálható Közvetlen gázok, illékony vegyületek, egykomponensű, tiszta anyagok Porlasztás (spray) HPLC, GC Ionizáció során keletkező hő Erős elektromos tér

8 Ionizálás Hő (+ töltéscsere elektrolitban) Elektromos mező Foton (lézer) Elektronütközés Atomok, ionok ütközése Elsősorban a minta anyagi minősége, stabilitása, oldószere határozza meg Befolyásolja az érzékenységet, kinyerhető szerkezeti infomációkat

9 Elektron-ionizáció (EI) Ütközés fűtött katódból kilépő elektron-nyalábbal (Re, 70eV) Könnyen gázfázisba vihető anyagok, Da-ig, magas hőmérséklet Intenzív, stabil, jól reprodukálható Anyagok szűk körére alkalmas, jelentős fragmentáció (in source decay, ISD) spektrumkönyvtárak

10 N Filament Extraction lenses Sample Inlet Collector Source magnets S

11 Elektrospray/ionspray ionizáció (ESI, ISI) Porlasztásos technika Fém kapilláris, 2-5 kv, szemben erős ellentétes töltés Külső csövön vezett porlasztógáz (N 2 ) Fűtött N 2 ellenáram oldószer párologtatás Nem illékony, poláros szerves vegyületek

12

13 Matrix assisted laser desorption ionisation (MALDI) Szerves mátrix (mustársav, α-ciano-4-oh-fahéjsav, 2,5-dihidroxi-benzoesav) Minta a mátrixszal fémfelületre szárítva Lézerimpulzusok a mátrix az elnyelt energia révén ionizálja és elpárologtatja a mintát Széles tömegtartomány, makromolekulák vizsgálata Gyors, kíméletes, érzékeny, keverék mintákhoz is jó

14

15 Ionok szétválasztása Statikus mágneses tér Dinamikus mágneses tér Statikus elektromos tér Dinamikus elektromos tér Kinetikus energia és repülési idő Tárolási idő

16 Quadrupol analizátor

17 TOF (time of flight) analizátor Detektorhoz való megérkezés ideje függ a tömegtől és a töltéstől (gyorsítófeszültség) Hosszú tér- és ütközésmentes útszakasz kell Korrekció (iontükör reflektron) Olcsó, jó felbontóképesség, széles tömegtartomány MALDI + TOF fehérjeanalitika

18 Detektorok A ionáram érzékelése A detektorok jellemzése: érzékenység ionáram változás követésének sebessége erősítési tényező elektromos zajszint (un. sötétáram) stabilitás (élettartam) Pontdetektorok (ionok szekvenciális detektálása) chaneltron Detektorsor (ionok szimultán detektálása) Alkalmazásuk:: mágneses analizátor

19

20 Felbontás R= m/ m 10 % szabály: két egyenlő intenitású csúcs között a völgy legfeljebb a csúcsmagasság 10 %-a Példa 1. Egyszeres töltésű m/z 1000 és 1001 ionok szétválasztásához R=1000 felbontás kell Példa 2. CO M=27, nominális tömegük: 28, m = 0, N 2 M=28, R = 2500 felbontás kell

21 Tandem tömegspektrometria I. MS/MS, MS 2

22 Tandem tömegspektrometria II. Lehetséges mérési módok parent/precursor ion scan ( anyaion pásztázás) daughter/product ion scan ( leányion pásztázás) constant neutral loss scan (konstans semleges vesztés) Selected ion / multiple reaction monitoring (SIM, MRM)

23

24 A tömegspektrometria orvosi alkalmazásai I. Mintabevitel: folyékony állapotú biológiai minta, megfelelően előkészített szérum, vércsepp, vizelet, liquor, szövetminta extraktum Egy vizsgálatból gyorsan, akár 30 féle anyagcserebetegségre adható diagnosztikai vélemény Fehérje (enzim) szintű diagnosztika szekvenciaeltérés azonosítása poszttranszlációs modifikációk azonosítása kvantitatív fehérje expressziós profil vizsgálata

25 A tömegspektrometria orvosi alkalmazásai II. Metabolit szintű diagnosztika: veleszületett anyagcsere-betegségek karnitin-észter profil meghatározás: primér/szekunder karnitinhiány, zsírsavoxidációs zavarok, szervessav aciduriák aminosav profil meghatározás: aminoacidopathiák guanidinovegyületek: kreatinszintézis zavarok epesavmetabolitok: epesavszintézis zavarok homocystein: hiperhomocysteinaemiák purinek, pirimidinek galaktosaemia szteroidszintézis, koleszterinszintézis zavarok hormonszintézis zavarok (trijódtironin, katekolaminok) szénhidrát-anyagcsere zavarai

26 A karnitin-észter profilvizsgálat diagnosztikus alkalmazása Vizsgált betegség Marker metabolit Vizsgált betegség Marker metabolit Zsírsavoxidáció rendellenességei Organikus aciduriák, acidaemiák Karnitin acilkarnitin transzlokáz defektus C16, C18-karnitin Propionaciduria C3-karnitin Karnitin Csökkent C0-karnitin Metilmalonsav acidaemia C3-karnitin, plazmamembrán /Cobalamin defektusok metilmalonil-karnitin transzporter defektus Karnitin palmitoil transzferáz I. Karnitin palmitoil transzferáz II. Emelkedett C0/C16 + C18 arány Izovaleriánsav acidaemia C5-karnitin C16, C18, C18:1-karnitin Glutársav acidaemia I. glutarilkarnitin MCAD C6, C8, C10:1-karnitin 3-metilkrotonil glicinuria C5OH, C5:1-karnitin SCAD C4-karnitin 3-metilglutakonátaciduria LCHAD C14OH, C16OH, C18OHkarnitin HMG-CoA liáz hiány C5OH, C6DCkarnitin VLCAD C14:1, C16:1-karnitin Biotinidáz deficiencia C3, C5OH-karnitin Többszörös acil CoA C4, C5, C8, C12-karnitin Mit. acetoacetil-coa C5:1, C5OH-karnitin dehidrogenáz tioláz hiány

27 Példák az aminosavprofil diagnosztikus alkalmazására glicin Nonketoticus hyperglycinaemia Detektált molekula Vizsgált betegség A betegség kialakulásának oka fenilalanin/tirozin Phenylketonuria fenilalanin-hidroxiláz enzim kóros működése vagy hiánya leucin/izoleucin Jávorfaszirup-betegség elágazó szénláncú ketonsavdekarboxiláz hiánya tirozin Tyrosinaemiák fumarilacetoacetáz/tirozinaminotranszferáz enzim defektusa glicin lebontásában szerepet játszó mitokondriális enzimek zavara metionin Hypermethioninaemia metionin-adenozil-transzferáz hiány metionin Homocystinuria cisztation-β-szintáz hiány citrullin Citrullinaemia arginin-szukcinát-szintetáz hiány arginin Argininaemia argináz hiány ornitin Ornithinaemia ornitin-ketonsav-aminotranszferáz hiány

28

29

30 A tömegspektrometria orvosi alkalmazásai III. Újszülöttkori szűrés Általában egészséges/teljes populáció vizsgálata, ebből a betegek felismerése Normál tartomány kijelölése; az egyes metabolitokra széles határok között mozoghat Cut-off értékek megállapítása Cél: durva eltérések és nem biológiai variabilitás kimutatása, kevésbé pontos módszer is elegendő

31 Proteomikai alkalmazások Móltömegmeghatározás Szekvenálás, azonosítás Diszulfid hidak helyzetének meghatározása Konformáció vizsgálata Aktív centrum / kötőhely meghatározása Fehérje-ligand kölcsönhatás tanulmányozása

32 Egyéb alkalmazások Gyógyszerkutatás: szennyezésprofil vizsgálat Igazságügy: pl. drog-screening, doppingszerek, mérgek Agrártudomány: pl. bor aktív alkotói (rezveratrol) Környezetvédelem (dioxinok), élelmiszeripar Nukleotid szekvencia meghatározás

33