A TÖMEGSPEKTROMETRIA ALAPJAI

Átírás

1 A TÖMEGSPEKTROMETRIA ALAPJAI Jegyzet Szerzők: Bóna Ágnes, Jámbor Éva, Márk László Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar 2015 A jegyzet a TÁMOP C-13/1/KONV számú, Az élettudományi-klinikai felsőoktatás gyakorlatorientált és hallgatóbarát korszerűsítése a vidéki képzőműhelyek nemzetközi versenyképességének erősítésére című projekt keretében készült.

2 Tartalomjegyzék 1. Bevezetés 3 2. A tömegspektrométer elvi felépítése 4 3. A vákuumrendszer 5 4. Mintabevitel 6 5. Ionforrások Elektron ionizáció Lágy ionizáció Kémiai ionizáció Szekunder ion tömegspektrometria Elektrospray ionizáció Légköri nyomású kémiai ionizáció Mátrix-segített lézer deszorpció/ionizáció Analizátorok Szektoros analizátor Kvadrupól analizátor Ioncsapda analizátor Repülési idő analizátor Detektor Fragmentálás és tandem tömegspektrometria A tömegspektrum A tömegspektrometria főbb alkalmazási területei Rövidítések Irodalomjegyzék 35 2

3 1. Bevezetés A tömegspektrometria (Mass Spectrometry, MS) az egyik legáltalánosabban alkalmazott analitikai eljárás, amely alkalmas szerves és szervetlen komponensekből képződött ionok tömeg/töltés (m/z) arányának nagyhatékonyságú meghatározására. Kezdetben az eljárást tömegspektroszkópiának nevezték, hiszen az ionok detektálása egy fluoreszkáló ernyőn történt, azonban ez az elnevezés napjainkban már nem használatos. A tömegspektrometria lényege, hogy a vizsgálandó vegyületek gáz halmazállapotú részecskéiből ionokat állít elő, majd ezeket relatív tömegük és töltésük hányadosa szerint elektromos és/vagy mágneses térben szétválasztja, végül detektálja. A tömegspektrometriás eljárások közel 100 éve járulnak hozzá a fizikai, kémiai, biológiai és orvostudományi kutatások rohamos fejlődéséhez. Napjainkban a tömegspektrométerek méretének és árának jelentős csökkenése nagyban elősegíti ezen módszerek elterjedését, így jelenleg ez az egyik legdinamikusabban fejlődő és legtöbbet alkalmazott analitikai eljárás. Rutinszerűen alkalmazható széles tömeg- és polaritás-tartományban különféle vegyületek tömegének és szerkezetének vizsgálatára. Intenzív a fejlesztések folynak a különböző ionforrások területén is, amelynek eredményeként jött létre a két leggyakrabban alkalmazott: mátrix-segített lézer deszorpciós (MALDI, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) és az elektrospray ionizációs (ESI, Electrospray Ionization) technika. Ezek kifejlesztése alapvető fontosságú volt a modern tömegspektrometria fejlődésében, hiszen segítségükkel lehetőség nyílt nagy molekulatömegű, nem illékony biopolimerek, peptidek, fehérjék valamint szintetikus rendszerek szerkezetének komplex tanulmányozására. Általánosan kijelenthetjük, hogy tömegspektrométerek rendkívül kis anyagmennyiségű minták (subfemtomol) gyors, pontos, megbízható analízisére alkalmas, az elválasztás-technikában használatos 3

4 módszerekkel (HPLC, UPLC, nanolc, nanouplc, GC, 1D/2D PAGE) jól kombinálható készülékek. 2. A tömegspektrométer elvi felépítése A tömegspektrométer készüléknek rendelkeznie kell mintabevivő rendszerrel, ionforrással, analizátorral és detektorral, valamint az ezekhez kapcsolódó számítógépes adatfeldolgozó és irányító rendszerrel (1. ábra). Az analizátor, a detektor és a nem légköri nyomáson működő ún. vákuum-ionforrások (pl. vákuum-maldi) viszonylag jelentős vákuum ( mbar) mellett üzemeltethetők megfelelően. A nagyvákuum az ion-molekula ütközések valamint az analizátor illetve a detektor falával történő ütközések minimalizálását szolgálja, hozzájárulva az ionizáció és a fragmentáció hatékonyságához. A nem kívánt kinetikai kölcsönhatások ugyanis módosíthatják az ionok repülési pályáit, részben vagy teljesen kiolthatják töltésüket, így reprodukálhatatlanná teszik a tömegspektrumot valamint csökkentik a műszer érzékenységét és felbontását. 1. ábra: A tömegspektrométer általános felépítése 4

5 3. A vákuumrendszer Az ionforrást elhagyó töltéssel rendelkező részecskék m/z értékének pontos meghatározása csak akkor lehetséges, ha az analizátorban és a detektorban az ionok energiája (a nem kívánt ütközések miatt) nem változik meg. Ennek érdekében a tömegspektrométer ezen részeiből el kell távolítani a gázmolekulákat. A modern tömegspektrométerekben a nagyvákuum előállítása két lépésben történik. Először egy elővákuum szivattyú mbar vákuumot hoz létre, erre a célra általában rotációs szivattyút alkalmaznak, de használható olajmentes csavarszivattyú is. A mbar nagyvákuumot egy vagy több turbómolekuláris szivattyú biztosítja. A tömegspektrométerben kialakuló tipikus nyomásértékeket a 2. ábra szemlélteti. A vákuumrendszer stabilitása és megbízható működése elengedhetetlen a tömegspektrométer megfelelő működéséhez, meghibásodásuk a tömegspektrométer számára végzetes lehet, mivel a nagyvákuumba hirtelen beáramló anyagok (olajgőz, vízpára) súlyosan károsítják a műszert és tartozékait. Ennek elkerülése érdekében a vákuumrendszer gondos karbantartást és folyamatos áramellátást igényel. 2. ábra: A tömegspektrométerben uralkodó nyomásviszonyok 5

6 4. Mintabevitel Tömegspektrometriával elméletileg bármilyen halmazállapotú sokkomponensű rendszer vizsgálható, azonban ezt nagyban befolyásolja az alkalmazott mintabeviteli és ionizációs technika. Általános szabály, hogy a mintát a tömegspektrométerbe való bevezetése előtt mindenképp gázhalmazállapotba kell juttatni, az ott uralkodó nagyvákuum miatt. Illékony vegyületeket (pl. gázok, könnyen párolgó anyagok) közvetlenül be lehet vezetni az ionforrásba, ahol az ionizáció megtörténik. Ha a vegyület nem illékony, akkor először fel kell oldani, majd valamilyen alkalmas megoldással gázfázisba juttatni, amely történhet pl. elektromos erőtér vagy porlasztás és szárítógáz segítségével. Az oldószer helyes megválasztása alapvetően befolyásolja a tömegspektrum minőségét. Általánosságban kerülendő a pufferek és a nem illékony sók alkalmazása. Egyszerű, néhány komponensű minták illetve kalibrációs standardok esetében alkalmazhatunk közvetlen adagolást, amely során egy automata infúziós pumpa és egy fecskendő segítségével juttatjuk a mintát tartalmazó oldatot az ionforrásba. Komplex biológiai mintáknál szinte minden esetben szükség van a komponensek előzetes elválasztásra is, amely során alkalmazhatunk többek között gázkromatográfot vagy HPLC készüléket. A fejlesztések folyamán, a folyadékkromatográfia és a tömegspektrometria összekapcsolása során a legnagyobb megoldandó probléma a vákuum stabilitásának megőrzése volt, hiszen az ionforrásba bekerülő mintamolekulák és oldószergőzök rontják a vákuumot. Azonban napjainkban a nagyhatékonyságú vákuum- és zsiliprendszerek használatával illetve a mikroés nano áramlási sebességek alkalmazásával ez a probléma kiküszöbölhető. A modern tömegspektrometriában a minta bevezetése és ionizációja párhuzamosan megy végbe, például a mátrix-segített lézer deszorpció/ionizáció (MALDI), az elektrospray ionizáció (ESI) valamint az atmoszférikus nyomású kémiai ionizáció (APCI) esetén is. A 6

7 lézer deszorpcióra épülő ionizációs eljárások során a mintabevitel szilárd állapotban történik, amelynek során a vizsgálandó mintát általában egy mátrix jelenlétében egy mintatartó tálcára kristályosítják. A mintatartók mérete és kialakítása igen változatos lehet, azonban a legelterjedtebb a 384 férőhelyes well-plate méretű formátum, amely könnyen lehetővé teszi a módszerek automatizálását. A mintatartók anyaga is eltérhet, általában valamilyen kémiai szempontból ellenálló fémből készülnek, így igen elterjedtek a rozsdamentes acél, alumínium és arany bevonattal ellátott tálcák, de léteznek egyszer használatos műanyag változatok is (3. ábra). Néhány klinikai (pl. lézersebészet) és gyógyszergyári alkalmazásnál elterjedőben van a közvetlen deszorpción alapuló ionizáció is, amely során a minta pl. gyógyszer tabletta, szövetminta közvetlenül érintkezik az ionizációt kiváltó lézerrel. 3. ábra: A MALDI TOF tömegspektrometriánál használatos, a minta töményítésére is alkalmas rozsdamentes acél mintatartó tálca 7

8 5. Ionforrások A tömegspektrometriában szükség van a vizsgált részecskék hatékony ionizálására, mivel a részecskék készülékben való mozgatása és szétválasztása az elektromos töltésükre gyakorolt hatás alapján történik. A megfelelő érzékenység eléréséhez elengedhetetlen az ionizációs paraméterek optimalizálása. Az ionizációs technika megválasztását főként a vizsgálandó molekula és az azt körülvevő mátrix határozza meg. Mivel univerzálisan alkalmazható ionizációs technika nincs, így a készülékek fejlődésénél meghatározó szerepű a különböző ionforrások cseréjének gyorsasága és egyszerűsége. Ennek következtében főként az atmoszférikus nyomású ionforrások terjedtek el, hiszen azok függetlenek a készülék vákuumrendszerétől így cseréjük, tisztításuk, karbantartásuk gyorsan és könnyen elvégezhető. A vákuum-ionforrások közül a legjelentősebb a MALDI, amely karbantartási igénye jóval kisebb a folyadékkromatográfiával kapcsolt változatokénál. 5.1 Elektron ionizáció A legrégebbi és igen gyakran alkalmazott eljárás az elektron ionizáció (EI). Ebben az esetben a minta egy fűtött katódból kilépő elektronnyalábbal találkozik és az ütközések révén elektronok lépnek ki, ezáltal pozitív ionok jönnek létre. Az elektronok ideális gyorsító feszültsége jellemzően 70 ev (elektronvolt). A módszer jól alkalmazható a könnyen gázfázisba vihető szerves vegyületek széles körének vizsgálatára kb Da molekulatömegig. Előnye, hogy intenzív, stabil, könnyen reprodukálható ionáramot biztosít és kompatibilis a legtöbb tömeganalizátorral. Hátránya azonban, hogy megfelelő eredményességgel csak a viszonylag illékony, kis molekulatömegű, stabil vegyületek esetében alkalmazható és a jelentős fragmentáció miatt a tömegspektrum bonyolult, a 8

9 molekulaion gyakran nem is jelentkezik. Az elektron ionizáció során alkalmazott magasabb hőmérsékleten egyes anyagok bomlást szenvedhetnek az alkalmazott ionizáló energiától függő mértékben. Ez a jelenség, a forrásban történő bomlás (In Source Decay, ISD), megfelelően alkalmazva hasznos szerkezetvizsgálati módszer, mivel további elemzésre felhasználható, anyagi minőségre jellemző töredékionok (fragmensek) képződnek. 5.2 Lágy ionizáció Az intenzív fragmentáció elkerülése érdekében alakultak ki az ún. kíméletes vagy lágy (soft) ionizációs technikák, amelyek kevesebb fragmentumot hoznak létre, így a spektrum egyszerűbb, könnyebben értékelhető. A lágy ionizációs módszereket három csoportba soroljuk úgy, mint részecske ütközéses technikák, párolgáson-porlasztáson alapuló módszerek és lézer deszorpciós módszerek. A részecske ütközésen alapuló technikák közé tartozik a kémiai ionizáció (CI), a szekunder ion tömegspektrometria (SIMS), a gyors atom- és ion ütköztetés (FAB, FIB) valamint a plazma deszorpció (PD). A párolgáson-porlasztáson alapuló eljárások a térdeszorpció (FD) és térionizáció (FI), a termikus porlasztásos (TS) továbbá atmoszférikus nyomáson lejátszódó kémiai- és fotoionizáció (APCI, APPI) valamint az elektroporlasztásos (ESI, nanoesi, DESI) ionizáció. A lézer deszorpciós (LDI) technikák közül jelentősebbek a mátrix-segített lézer deszorpció/ionizáció (MALDI) és a felület-segített lézer deszorpció/ionizáció (SELDI) Kémiai ionizáció Kíméletes eljárást jelent a kémiai ionizáció (Chemical Ionization, CI), melynek lényege, hogy először egy nagy feleslegben jelenlévő reagens gázt ionizálunk, azután az így képződött ionok 9

10 a minta molekuláival reagálva azokat ionizálják. A reagens gáz feleslegben történő alkalmazása megvédi a minta molekuláit az elektronokkal történő közvetlen ionizációjától. Azt a jelenséget, amikor az ionizáció ion-molekula kölcsönhatás eredményeként jön létre, először J. J. Thomson figyelte meg hidrogén gázban 1913-ban. A leggyakoribb reagens gázok: metán, izo-bután, ammónia, klór, dinitrogén-oxid. Mivel a kölcsönhatások valószínűsége arányos a nyomással, ezeket az ionforrásokat általában légköri nyomáson működtetik. Ennek a módszernek az előnye a kíméletes ionizáció, így kevesebb fragmens ion képződik, valamint általában megjelenik a spektrumban a pozitív vagy negatív töltésű molekulaion. Pozitív ionizáció esetén gyakori a [M+H] + protonált kvázi-molekulaion megjelenése is. Azonban a detektálhatóság felső tömeghatára (hasonlóan az elektron ionizációhoz) megközelítőleg 1000 Da Szekunder ion tömegspektrometria A szekunder ion tömegspektrometria (SIMS) esetében a sík általában fém felületen elhelyezett mintát részecske- vagy ionnyalábbal bombázzuk és a mintából kibocsátott szekunder ionokat analizáljuk. Ide tartozik a plazma deszorpció és a folyadék szekunderion tömegspektrometria (LSIMS). A plazma deszorpció (PD) elve, hogy a vizsgálandó mintát vékony filmrétegre viszik fel, és e mögé, a mintával ellentétes oldalra, helyezik el az erősen α-sugárzó 252 Cf radioaktív izotópot. Az izotópból kilépő nagy energiájú hasadási termékek a mintán történő áthaladáskor helyi felmelegedést okoznak és mikroplazmát hoznak létre; így energiát adnak át a minta molekuláinak, amelyek ionizálódnak és deszorbeálódnak. A PD MS volt az első módszer, amelynek segítségével lehetővé vált a nagy molekulatömegű fehérjék, illetve az összetett antibiotikumok vizsgálata. 10

11 A folyadék szekunderion tömegspektrometria (LSIMS) technika napjainkban is használatos elsősorban a hőre érzékeny, vagy nem illékony kis és közepes molekulatömeggel rendelkező anyagok esetében. A technikán belül két alapvető módszert különíthetünk el. A gyors atombombázás (Fast Atom Bombardment, FAB) során egy atomágyúból gyors argon vagy xenon nyalábot bocsátanak a mintára, mely egy viszkózus, kevéssé illékony folyadékban, többnyire glicerinben van oldva. A gyors ionbombázás (Fast Ion Bombardment, FIB) esetében céziumionokat (Cs + ) alkalmaznak. A részecskék a folyadékfelszínbe ütközve energiát adnak át a felszínnek, ami eloszlik a felületi réteg minta-mátrix molekulái között, azok ionizációját eredményezve. A képződő minta és mátrix ionok kiszakadnak a felszínről és az így létrejött szekunderionokat analizáljuk. A folyadékfilm felületi rétege diffúziós folyamatok révén állandóan pótlódik, frissül, ennek köszönhetően az analizált felület folyamatosan regenerálódik. A FAB hőérzékeny, poláros, Da tömegű molekulák, a FIB elsősorban nagyobb részecsketömegek (akár Da) vizsgálatára alkalmas. A módszer szerkezeti információkat is nyújt, mivel jellegzetes fragmensionok is képződnek. Napjainkban is folyamatos a módszer fejlesztése, többek között nagyon ígéretes eredményeket értek el fullerénionok (C + 60 ) ionizáló részecskeként történő alkalmazásával. A térdeszorpció és a térionizáció a deszorpciós módszerek közé tartozó rokon ionizációs technikák, melyek főként történelmi jelentőséggel bírnak. Mindkét esetben a minta ionizációját erős elektromos tér váltja ki, a módszerek tulajdonképpen csak a mintabeviteli módban különböznek egymástól. Ugyan a vizsgált részecskék szerkezetéről kevés információt szolgáltatnak, azonban tömegpontosságúk jó. 11

12 5.2.3 Elektrospray ionizáció A porlasztáson alapuló ionizációs eljárások különösképpen a folyadékkromatográfiával kapcsolt tömegspektrométerek esetében számítanak nélkülözhetetlen megoldásnak. A módszer elvét már az 1960-as években kigondolták, de a megvalósítás az 1980-as évekig váratott magára. A termikus porlasztás jelentette az első igazi előrelépést a hőre érzékeny, nem illékony anyagok MS, illetve LC-MS vizsgálatának területén. Elve, hogy a folyadékkromatográfiás oszlopon szétválasztott komponenseket és a mozgófázist nagy nyomással egy elektromosan melegített ( ºC) fém kapillárisba juttatják, amelynek a vége a tömegspektrométer ionforrásában van, így a minta és az oldószergőzök nagy sebességű ionizált spray formájában kerülnek be a tömegspektrométerbe. Ebben az esetben az ionizációt az oldószer (mozgófázis) illékony elektrolitjai valósítják meg. A leggyakrabban alkalmazott porlasztásos ionizációs forma az elekrospray (ESI, nanoesi), melynek során a kromatográfról lejövő minta egy fém vagy fémbevonatú szilika kapillárison halad keresztül, melyre 2-5 kv feszültséget kapcsolnak. A kapilláristól és a tőle 1-2 cm-re, nanoesi esetén néhány mm-re elhelyezett, ellentétes töltésű elektród között erős elektrosztatikus tér képződik, melynek hatására a kapillárisból kilépő folyadék kúpszerűen kicsúcsosodik (Taylor-kúp). Ezután a Taylor-kúpból egy vékony folyadéksugár lép ki az ellentétes töltésű elektród felé. Az így keletkezett folyadéksugár töltéssűrűsége igen nagy, instabil, ezért kisebb töltéssel rendelkező folyadékcseppekre bomlik. Az azonos töltésű cseppek között Coulomb-féle taszító erő lép fel, melynek eredményeként finom eloszlású elektrospray jön létre. A technika továbbfejlesztése nagyobb áramlási sebességek ( μl/perc) mellett is jól alkalmazható. Itt a kapilláris körül elhelyezkedő külső csőben vezetett inert porlasztógázzal, mely többnyire nitrogén, pneumatikusan hozzuk létre a töltött aeroszolt a folyadékmintából. A folyadékcseppekből az oldószer párolását egy további, nagy 12

13 mennyiségű, fűtött ( ºC) nitrogén árammal segítjük elő. A párolgás során a cseppecskék térfogata csökken, így a felületi töltéssűrűség egyre nagyobb lesz. Ez a folyamat egészen addig folytatódik, amíg az elektrosztatikus taszítás értéke eléri a felületi feszültség értékét (Rayleigh-határ), ami végül a cseppek felbomlását (Coulomb-robbanás) okozza. A folyamat végén a mintából származó kompakt, többszörösen töltött ionokat kapunk (4. ábra), mely lehetővé teszi a nagyobb molekula tömegű ionok, kisebb tömegtartománnyal rendelkező tömegspektrométerekkel történő mérését is, mivel az egyes ionok töltésétől függően az m/z értéke a felére, harmadára stb. csökken. Az ESI elsősorban a nem illékony, poláros, bázikus csoportot hordozó molekulák vizsgálatához ideális. 4.ábra: Az elektrospray ionforrás (ESI) vázlatos működési elve Légköri nyomású kémiai ionizáció A porlasztásos és a kémiai ionizációs eljárások kombinációja a légköri nyomású kémiai ionizáció (Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI). Az aeroszol képződése és elpárologtatása az ESI-nél ismertetett módon történik, de itt nem a kapilláris, hanem a mintaárammal szemben elhelyezkedő elektród áll nagyfeszültség alatt (korona feszültség). A 13

14 koronakisülések hatására az elpárolgott víz- és egyéb oldószer-molekulák ionizálódnak ezáltal protonálják az itt áthaladó mintát is (5. ábra). Ezt a folyamatot az ellenáramban áramoltatott nitrogén gáz is segíti. A módszer nagy előnye, hogy lényegében bármilyen oldószer és puffer mellett használható, hátránya az alacsony kimutatási határa (<1000 Da) valamint, hogy csak közepesen poláros anyagok esetén alkalmazható megfelelően. 5. ábra: Atmoszférikus nyomású kémiai ionforrás (APCI) vázlatos felépítése Mátrix-segített lézer deszorpció/ionizáció A lézer deszorpció/ionizáció (LDI) lényege a mintamolekulák lézersugárral történő elpárologtatása és ionizációja, azonban ilyenkor gyakran keletkeznek rövid élettartalmú fragmens ionok. A probléma megoldását a 1980-as évek végén kifejlesztett mátrix-segített lézer deszorpció/ionizáció (MALDI) jelentette. Ezen ionizációs technika során a mintamolekulákhoz kis molekulatömegű szerves ún. mátrix anyagot keverünk, amely elnyeli és közvetíti a lézer energiáját a vizsgálandó anyagnak, illetve ionizálja azt, miközben meggátolja a keletkezett ionok fragmentációját. A módszer egyik legkényesebb pontja az adott vizsgálathoz optimális mátrix kiválasztása, általában mustársavat (SA), α-ciano-4- hidroxi-fahéjsavat (HCCA, CHCA), 2,5-dihidroxi-benzoesavat (DHB) alkalmazunk. A mintaelőkészítés során a mátrix és a mintaoldat keverékét (0,2 2 μl) a mintatartóra szárítjuk úgy, 14

15 hogy lehetőleg homogén mikrokristályos szilárd elegyet kapjunk. A gyors lézer impulzusok ( Hz) ebből a szilárd felületből párologtatnak el anyagot, és ez az ionizált részecskefelhő kerül az analizátorba (6. ábra). Az alkalmazott lézererősség nem csak a mátrix típusától, hanem a mátrix és a minta arányától is függ. Ha a minta aránya a mátrixnál sokkal kisebb, a megfelelő jelintenzitás eléréséhez jóval több minta elpárologtatására van szükség, ami a lézerintenzitás növelésével érhető el. Ugyanez igaz fordított esetben is, csak ekkor a mátrix alacsony koncentrációja okozza a jelintenzitás csökkenést a detektorban. A MALDI mérések során a lézer erősségét úgy választjuk meg, hogy az éppen az ionizációhoz szükséges küszöbértéket elérje, ezért az egyes mérések során legalább lézerlövés összesített átlaga adja a végső tömegspektrumot. A MALDI segítségével igen kíméletesen, de hatékonyan ionizálhatóak még a nagy tömegű, bomlékony molekulák is (fehérjék, szénhidrátok, oligonukleotidok, polimerek), így igen elterjedt módszer a biológiai és orvostudományi kutatásokban. További előnye az óriási mintaáteresztő képessége, amely napi több ezer minta automatizált vizsgálatát is jelentheti. 6. ábra: A mátrix-segített lézer deszorpció/ionizáció elve 15

16 6. Analizátorok Az analizátorban történik a képződött ionok szétválasztása a tömegük és a töltésük hányadosa (m/z) szerint. Minél kisebb az ion tömege illetve minél nagyobb a töltése, annál nagyobb sebességre képes szert tenni egy adott elektromágneses erőtér hatására. Lényegében ezt használják ki az ionok transzportján alapuló módszerek. Az újabb, modernebb készülékek inkább az ionok szelektív tárolása révén választják szét a részecskéket. Az analizátor jellemző paraméterei: a maximális vizsgálható m/z érték, az áteresztőképesség (a detektált és a képződött ionok számának hányadosa), illetve egy adott tömegre jellemző maximális felbontóképesség (molekulatömeg/csúcsszélesség). A Fourier-transzformációs tömegspektrométerek esetében az utóbbi érték elérheti akár az egymilliót is. 6.1 Szektoros analizátor A legrégebbi típusok a szektoros analizátorok, ahol az ionok a haladásukra merőleges mágneses térbe jutnak. Itt az elektromágneses impulzusuk és a töltésük szerint különböző sugarú körpályákra térülnek. A mágneses térerősség értékét változtatva más és más ionok juttathatók a detektorra. Az ionnyalábot ezt követően egy elektrosztatikus analizátorban sebesség szerint fókuszálják, ahol az ionok a haladásukra merőleges elektromos térerősség mellett, a kinetikus energiájuknak megfelelő körpályát követnek (7. ábra). A szektoros készülékeket a nagy felbontás, nagy érzékenység és széles mérési tartomány jellemzi. Hátrányuk, hogy drágák, lassúak, nagy a technikai háttérigényük, napjainkban az izotóparány méréseknél van gyakorlati jelentőségük. 16

17 7. ábra: Kettős fókuszálású szektoros analizátor felépítése 6.2 Kvadrupól analizátor Az egyik legelterjedtebb analizátor típus az ún. kvadrupól (quadrupol, Q). Itt az ionok négy párhuzamos henger alakú rúd között haladnak, amelyekre egyenáramot és nagyfrekvenciás váltóáramot kapcsolnak. A szemben lévő rudak azonos, a szomszédosak ellentétes polaritásúak, így közöttük oszcilláló elektromágneses tér alakul ki. A kvadrupólba bejutó különböző m/z értékkel rendelkező ionok különböző amplitúdójú kitéréseket végezve haladnak, azonban a rudak közti ideális pályát csak meghatározott m/z értékű ionok képesek tartani, a többi ion vagy elveszti a kinetikus energiáját vagy a rudakba csapódik (8. ábra). A rudakra kapcsolt váltóáram frekvenciáját változtatva a kvadrupól mindig más-más m/z értékkel rendelkező ionokat enged a detektorba, így a teljes tömegtartomány végig pásztázható. A kvadrupól készülékek viszonylag egyszerűbben működtethetők, gyorsak, mennyiségi vizsgálatokra kiválóan használhatóak, mivel lineáris tartományuk

18 nagyságrend, valamint jól kombinálhatók különféle ionforrásokkal és analizátorokkal. Hátrányuk, hogy tömegpontosságuk és felbontóképességük viszonylag alacsony. 8. ábra: A kvadrupól analizátor felépítése és működési elve 6.3 Ioncsapda analizátor Hasonló elven működik az ioncsapda (iontrap, IT), amelynél egy gyűrű alakú, és két másik elektród között jön létre az oszcilláló háromdimenziós elektromágneses tér. A bejutott ionok ebben az erőtérben haladnak egy körpályára kényszerítve, míg a körre merőleges irányban rezgéseket végeznek (9. ábra). 9. ábra: Lineáris (2D) ioncsapda analizátor felépítése 18

19 Lényeges újítás, hogy itt az ionok szétválasztása nem térben, hanem időben történik, ha növeljük a váltóáram amplitúdóját, akkor az ionok rezgőmozgása egyre fokozottabb lesz, és növekvő m/z sorrendben távoznak a kilépési elektród nyílásán a detektor felé (ún. tömegszelektív instabilitási üzemmód). Az ioncsapda előnye a nagyobb érzékenység és felbontóképesség, a gyorsabb működés, szélesebb mérési tömegtartomány és a többszörös fragmentáció (MS n ) lehetősége. Hátránya a mennyiségi mérések korlátozott lehetősége (lineáris tartomány kb. 4 nagyságrend). Az ioncsapdás készülékek sikerét reprezentálja, hogy kereskedelmi forgalomban számos típusuk érhető el, így léteznek lineáris (2D, LTQ) és 3D ioncsapdák illetve (10. ábra) ún. orbitrap analizátoros (11. ábra) készülékek. Ez utóbbiakra jellemző a rendkívüli tömegpontosság és felbontóképesség. 10. ábra: 3D ioncsapda analizátor felépítése 11. ábra: Az orbitrap analizátor vázlatos felépítése 19

20 6.4 Repülési idő analizátor Az elektrotechnika fejlődésével lehetővé vált igen kicsiny időkülönbségek pontos észlelése, amely a repülési időn (Time-of-Flight, TOF) alapuló elválasztás alapját képezi. A megoldás lényege, hogy az elektromosan térmentes repülési csőbe azonos időpillanatban, azonos kinetikai energiával rendelkező ionok kis csomagjai érkeznek, és a detektort az m/z értékükkel arányos repülési idő után érik el (12. ábra). A kisebb m/z értékkel rendelkező ionok előbb, a nagyobb tömegű ionok később érik el a detektort. Megfelelő ionforrással (MALDI) kombinálva a nagyobb biomolekulák vizsgálatában nélkülözhetetlenek. A MALDIhoz ideális a repülési idő analizátor, mivel általa kihasználható a több száz Da-os felső tömeghatár, valamint nagy felbontás és érzékenység érhető el. A modern TOF analizátorokban a kisebb tömegű ionokat (pl. peptidek) egy iontükör (reflektron) kinetikus energiájuk (m/z értékük) szerint újrafókuszálja. Az ionok addig hatolnak be a reflektronba, míg kinetikus energiájuk nulla nem lesz, így a nagyobb kinetikus energiával rendelkező ionok hosszabb, a kisebb energiájú ionok rövidebb utat tesznek meg, mielőtt az ellenkező irányban elhagynák a reflektront és a detektorba csapódnának. A reflektron révén a TOF készülékekkel ma már igen jó felbontóképesség, széles mérési tartomány érhető el illetve alkalmazásukkal megvalósítható többféle fragmentációs lehetőség is. 12. ábra: A repülési idő analizátor felépítése és működési elve 20

21 7. Detektor A tömegspektrométerben haladó ionok csoportja lényegében a forrástól a detektorig tartó elektromos áramot jelent. A készülékek detektorai a hozzájuk érkező rendkívül kis ionáramot ( A) érzékelik, és értékével arányos analóg elektromos jelet képeznek. A pontdetektorok az időben szétválasztott, a sordetektorok pedig a térben elkülönített ionok érzékeléséhez használatosak. Alapvető követelmény, hogy a detektorok képesek legyenek követni az ionáramok igen gyors változásait, tehát memória-effektusuk kicsi legyen. A legelterjedtebben alkalmazott típus a mikrocsatornás detektor (14. ábra). A kapott kis jeleket többnyire elektron- vagy foton-sokszorozókkal felerősítik, majd számítógépes feldolgozás céljából digitalizálják. 14. ábra: Mikrocsatornás detektor vázlatos működési elve 21

22 8. Fragmentálás és tandem tömegspektrometria Ha viszonylag kis energiával ionizáljuk a vizsgálandó anyagunkat, akkor a molekulák egészben maradnak, és a tömegükre és töltésükre jellemző ún. molekulacsúcsot [M +, M - ] kapunk. Többnyire azonban jóval nagyobb mennyiségű információ nyerhető, speciális problémákra (pl. több anyag elkülönítése, szekvenálás) jobb megoldást jelent, ha a részecskéket kinetikus energia hozzáadásával pontosan szabályzott módon széttördeljük, fragmentáljuk. Ez a folyamat történhet az ionizációs folyamat során, illetve röviddel utána (in source és post source decay, ISD, PSD), vagy az analizátorban egy inert gázzal való ütközés révén (collision induced dissociation, CID és electron transfer dissociation, ETD). A keletkező fragmentumok kémiai felépítése és aránya az anyaion anyagi minőségétől és az alkalmazott energiától függ, így további tömegspektrometriás vizsgálatra használható fel. Természetesen ilyenkor csak azok a fragmentumok, más szóval leányionok jönnek szóba, amelyek az eredeti töltést tovább hordozzák. Ezt a jelenséget használják ki a tandem tömegspektrometria jelölése: MS/MS vagy MS n - esetében, amikor két egymás után kapcsolt analizátor közé egy jellemzően argon, hélium vagy nitrogén gázzal működtetett ütközési cellát (collision cell) iktatnak. Itt lehetőség van az első analizátorban szétválasztott ionok egyenkénti fragmentálására, és a leányionok szelektív vizsgálatára. Tipikus megoldás a QqQ elrendezés, ahol két kvadrupol analizátor közé kerül a cella. Az ioncsapda esetén kissé más a helyzet: itt a fragmentációt megelőző és követő folyamatok nem térben, hanem időben válnak szét egymástól egyetlen analizátorban. Fontos tudni, hogy a rutinszerűen használt készüléktípusokban a fragmentáció az ionintenzitás 1-2 nagyságrenddel való csökkenését okozza, így tényleges gyakorlati haszna az MS/MS és MS 3 méréseknek van. 22

23 Mérési üzemmódok tandem tömegspektrométerrel: Egyedi ion vizsgálat (single ion recording): az egyik analizátor egy bizonyos m/z értéknél enged át, a másik nem aktív (15. ábra). 15. ábra: Az egyedi ionkiválasztás sematikus működése Pásztázás (scan): az egyik analizátor egy bizonyos m/z tartományt pásztáz, a másik nem aktív (16. ábra). 16. ábra: A teljes pásztázás elvi működése 23

24 Többszörös reakció megfigyelés (multiple reaction monitoring): mindkét analizátor egy-egy bizonyos m/z értéknél enged át; általában egy iont és valamely fragmentumát. Több, független fragmentációs átmenet vizsgálható így (17. ábra). 17. ábra: A többszörös reakció megfigyelés elve Anyaion pásztázás (parent ion scan): az első analizátor egy tartományt pásztáz, a második pedig egy bizonyos m/z értéknél enged át. Azokat az ionokat vizsgálhatjuk, amelyek egy bizonyos méretű töltött fragmentumot adnak (18. ábra). 18. ábra: Prekurzor ion pásztázás 24

25 Leányion pásztázás (daughter ion scan): az első analizátor egy bizonyos m/z értéknél enged át, a második pedig egy tartományt pásztáz. Megvizsgálhatjuk, hogy egy bizonyos méretű ion milyen fragmentumokra esik szét (19. ábra). 19. ábra: A fragmens ion pásztázás elvi működése Állandó semleges vesztés (constant neutral loss): mindkét analizátor pásztázó módban működik, de a második egy állandó m/z értékkel lejjebb. Azok az ionok vizsgálhatók, amelyek egy bizonyos méretű semleges fragmentumot képeznek (20. ábra). 20. ábra: A semleges vesztéses pásztázás elve 25

26 Az analizátor típusok bármilyen kombinációja (MS/MS) elképzelhető az ún. hibrid készülékekben, amelyek két, vagy több különböző típusú analizátor összekapcsolásából jönnek létre. A rutin vizsgálatok során leggyakrabban hibrid típusú készülékeket alkalmaznak, amelyek közül a legelterjedtebb kombinációk a Q-TOF, Q-IT, IT-TOF megoldások (13. ábra). Az MS/MS készülékekben az első analizátor általában az ionok kiválasztásáért, míg a második, nagyobb felbontóképességgel rendelkező analizátor a pontos m/z érték meghatározásáért felelős. 13. ábra: Példák hibrid tömegspektrométerekre: a) Q-TOF kombinált analizátor b) Q-IT hibrid MS 26

27 9. A tömegspektrum A tömegspektrum a tömeg/töltés (m/z) arány és az ionintenzitás függvényszerű ábrázolása. A tömegspektrometriában leggyakrabban használt tömegegység a dalton (Da), amely a 12 C atom tömegének egy tizenketted része. A legintenzívebb csúcs a báziscsúcs, ehhez viszonyítjuk az összes többi komponenst. Az abszolút ionmennyiség arányos a mintában jelenlévő anyagmennyiséggel, a fragmentumok relatív ionintenzitásai pedig a molekulatípusra és az alkalmazott mérési eljárásra jellemzőek. A készülékre, így a kapott tömegspektrumra is jellemző a felbontóképesség, amely azt a R=m/Δm értéket jelenti, ahol m a tömegszám, melytől egy szomszédos csúcsot még éppen el tudunk különíteni. Ehhez meg kell adni, hogy a két csúcs közös átfedő szakasza legfeljebb milyen relatív magasságú lehet, Δm a két csúcs tömegének különbsége (illetve helyesebb m/z és Δ[m/z] értékekről beszélni). A felbontóképesség a nagyobb tömegek felé haladva általában csökken, tipikusan értékű. 10. A tömegspektrometria főbb alkalmazási területei Minél többet tudunk a gének szerepéről, annál világosabbá válik a fehérjék és azok módosításainak szerepe a patológiás folyamatokban. A proteomika összetett fehérjekeverékek valamint azok enzimatikus emésztményeinek egyidejű vizsgálatát jelenti. A proteom kutatás módszertana egyszerű: az egészséges és a beteg rendszer fehérje készletét összehasonlítva olyan markereket fedezhetünk fel, amelyek egyértelmű diagnózis felállítását teszik lehetővé. Tehát az adott pillanatban minőségi és lehetőleg mennyiségi vizsgálatot kell végezni az adott fiziológiás állapotú sejt teljes fehérjeállományáról és azt össze kell vetni a kísérletesen manipulált, vagy beteg sejt proteomjával. A különbséget okozó fehérjék vagy fehérje 27

28 töredékek mennyiségi és minőségi analízise, pontos szekvenciájának és kovalens módosításainak meghatározása diagnosztikai célokat szolgálhat. A MALDI TOF tömegspektrometria által biztosított széles tömegtartomány miatt célszerűen két detektort alkalmazunk. A kis tömegű ionokat a nagyobb úthosszat biztosító reflektron detektorban, míg a nagyobb tömegűeket lineáris módban mérjük. A kimutatási határ rutinszerűen femtomol nagyságrendű. A készülékkel megvalósítható tandem tömegspektrometria (TOF/TOF) is, melynek során az ionforrásból kilépő részecskéket két módon fragmentálhatjuk: közvetlenül az ionforrás után (PSD) vagy argongáz segítségével egy erre a célra kialakított ütközési cellában (CID, ETD). A valóságban ez a megoldás azért bonyolult, mert több tízezer fehérje vagy peptid egyszerre történő analíziséről van szó. Ma a legelterjedtebb módszer az, hogy valamilyen elválasztás technikai módszerrel a több tízezer fehérje, peptid közül kiválasztják azt a nagyobb csoportot (szubproteomot), amelyben az összehasonlítani kívánt peptidek, fehérjék megtalálhatók. Erre a célra a gélelektroforézis vagy a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia a legalkalmasabb, ezt követően a frakciókat tisztítjuk és enzimatikusan emésztjük. Az így kapott peptid keverékhez meghatározott arányban mátrix-oldatot keverünk és az elegyet mintatartó tálcára szárítjuk. A mátrix kiválasztásánál a molekula típusát, polaritását valamint molekulatömegét is figyelembe kell venni. Ennek megfelelően a fehérje emésztmények (molekulatömeg < 5 kda) elemzéséhez ideális mátrix az α-ciano-4-hidroxifahéjsav (HCCA, CHCA). A vizsgálat során rögzítjük a peptid keverékre jellemző tömegspektrumot, majd a kiértékelés során megfelelő matematikai átalakítások után az eredményeket elküldjük egy fehérje szekvenciákat tartalmazó adatbázisba (Mascot, SwissProt, NCBInr). A keresés eredményeként megkaphatjuk az adott tömegspektrum által meghatározott fehérjét vagy fehérjéket. Ezt a meghatározási módszert Peptide Mass Fingerprinting-nek (PMF) nevezzük. 28

29 A gyulladásos betegségek laboratóriumi diagnosztikájában alapvető jelentősége van a sejten belüli jelátviteli utak monitorozásának. A patológiás folyamatok detektálásának leggyorsabb módja a jelátviteli utak fontosabb enzimjeinek, fehérjéinek kovalens módosításának meghatározása, mely többek között jelenthet foszforilációt, farnezilációt, lizin oldal-láncok acetilezését és fehérjék ADP-ribozilezését is. A MALDI TOF tömegspektrometria segítségével azonosíthatjuk a különböző fehérje módosításokat valamint azokat a fehérjéket, melyek fontos szerepet játszhatnak különböző folyamatok patomechanizmusában illetve a diagnosztikus értékű fehérjéket egyaránt. A meghatározás során a PMF-hez hasonlóan rögzítjük az elsődleges tömegspektrumot, majd ezt követően a nagyobb intenzitású vagy diagnosztikailag jelentős peptideket PSD vagy CID fragmentációval tovább bontjuk. Így meghatározható a peptidek pontos elsődleges szerkezete és annak módosulása valamint eddig ismeretlen peptidek és proteinek felépítése (De Novo szekvenálás). A diagnosztikai jelentőségű peptidek és fehérjék kimutatására viszonylag kevés példát találunk. Utóbbiban jelentős szerepet játszhat a központi idegrendszerben, igen kis mennyiségben előforduló hipofízis adenilát-cikláz aktiváló polipeptid (PACAP) jelenlétének, lokalizációjának és mennyiségének MALDI TOF és LC-MS tömegspektrometriás vizsgálata (21. ábra). A PACAP nagyobb mennyiségben a központi és perifériás idegrendszerben fordul elő, de megtalálható többek között az endokrin mirigyekben, az ivarszervekben, a gasztrointesztinális traktus teljes hosszában valamint a kardiovaszkuláris rendszerben egyaránt. A PACAP számos, az endokrin rendszert érintő hatása mellett antiapoptotikus valamint neuroprotektív, az idegrendszer fejlődését befolyásoló szerepe is jelentős. 29

30 21. ábra: A hipofízis adenilát-cikláz-aktiváló polipeptidjének (PACAP-38) MALDI TOF tömegspektrometriás vizsgálata a) A PACAP-38 protonált kvázimolekula ionja lineáris detektálási módban b) A PACAP-38 nátriummal képzett kvázimolekula ionja lineáris detektálási módban c) A PACAP-38 triptikus peptidjének azonosítása reflektron módban 30

31 A tömegspektrometriára épülő peptidomika és proteomika egyik legnagyobb felhasználási területe az onkológia. A belignus és malignus elváltozások korai fázisban történő diagnosztizálása és megkülönböztetése valamint a gyógyszeres- és sugárterápia hatásának nyomon követése egyaránt elvégezhető a modern tömegspektrometria segítségével. Az irodalomban számos olyan közleményt találunk, amelyekben proteomikai vizsgálat segítségével, a tumorra jellemző, korai fázisban is kimutatható biomarkereket azonosítottak különböző testfolyadékokból (vér, szérum, vizelet, nyál stb.). Potenciális tumorbiomarkerek lehet például az annexin 1 és 2 valamint a peroxiredoxin-2 fehérjék, amelyek hatékonyan mutathatóak ki kíméletes módon, például a betegek nyálából. A tömegspektrometria igen gyors és hatékony diagnosztikai módszer lehet a fertőző humán patogének kimutatására egyaránt. A Mycobacteriumok sejtmembránjában nagy mennyiségben jelen levő mikolsavak jelenléte igen jól vizsgálható MALDI TOF tömegspektrometriával. A módszer érzékenységét jellemzi, hogy még több száz éves Mycobacterium tuberculosis-sal fertőzött csontminták esetében is eredményesen alkalmazható. Napjaink egyik legizgalmasabb fejlesztése a MALDI TOF tömegspektrometria képalkotó módszerként történő alkalmazása (MALDI Imaging), melynek során egy speciális mintatartóra mikronos szövettani metszetet és mátrixot szárítunk. Ezt követően a mintáról előre meghatározott módon és lézerintenzitással több ezer tömegspektrumot veszünk fel, amelyeket a megfelelő szoftver, az egyes m/z értékekhez tartozó intenzitások eloszlása alapján képként jeleníti meg. A gyógyszergyárak számára rendkívüli jelentősséggel bír a felhasznált vegyületek lehetséges bomlástermékeinek ismerete. A MALDI TOF tömegspektrometria segítségével a gyógyszerhatóanyagok stabilitásvizsgálata is elvégezhető. Ilyenkor a minták azonos mennyiségeit speciálisan előkészített mintatartó tálcára cseppentjük, majd analizáljuk. A 31

32 vizsgálatok után a hatóanyagokat tartalmazó tálcákat akár -70 C-on tárolhatjuk és a későbbiek folyamán mérhetjük a molekulák szerkezetében bekövetkező változásokat. A tömegspektrometria alkalmazása az orvosi laboratóriumi diagnosztikában már eddig is számos, a medicina számára nagy fontosságú anyag vizsgálatát tette lehetővé, vagy éppen egyszerűbbé, pontosabbá. Az elemzés alá vont molekulák köre folyamatosan bővül, gyakran egész betegségcsoportokat lefedő tematikus panelekbe rendeződik. Nem elhanyagolható körülmény, hogy a tömegspektrometriás eljárások sok esetben gazdaságilag is a legkedvezőbb megoldást kínálják más, hagyományosabb technikákkal összehasonlítva. Természetesen arról sem szabad megfeledkezni, hogy az alapberuházás és a szervizelés költségei igen magasak. Az MS, különösképpen megfelelő kromatográfiás elválasztással és tandem mérési módozattal kombinálva, az egyik leghatékonyabb technológia jelenleg a szerves molekulák vizsgálata terén. Óriási előnye, hogy egyetlen rövid méréssel, melyet gyakran csak egyszerű mintaelőkészítés előz meg, nagyszámú vegyület elemzésére van lehetőség, továbbá ez a repertoár viszonylag könnyen és olcsón bővíthető. A jövőben várhatóan egyre több módszer fog átvándorolni az MS alkalmazások területére. 32

33 11. Rövidítések APCI: légköri nyomású kémiai ionizáció (Atmospheric Pressure Photoionization) APPI: légköri nyomású fotoionizáció (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) CHCA, HCCA: α-ciano-4-hidroxifahéjsav (α-cyano-4-hydroxycinnamic Acid) CI: kémiai ionizáció (Chemical Ionizaiton) CID: ütközés indukált disszociáció (Collision Induced Dissociation) DESI: deszorpciós elektrospray ionizáció (Desorption Electrospray Ionization) DHB: 2,5-dihidroxi-benzoesav (2,5-Dihydroxybenzoic Acid) EI: elektron ionizáció (Electron Ionization) ESI: elektrospray ionizáció (Electrospray Ionization) ETD: elektron átadásos dissziociáció (Electron Transfer Dissociation) FAB: gyors atomütköztetés (Fast Atom Bombardment) FD: térdeszorpció (Field Desorption) FI: térionizáció (Field Ionization) FIB: gyors ionütköztetés (Fast Ion Bombardment) GC-MS: gázkromatográfiával kapcsolt tömegspektrometria (Gas Chromatography-Mass Spectrometry) HPLC: nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (High Pressure Liquid Chromatography) ISD: forrásban történő bomlás (In Source Decay) LC-ESI: folyadékkromatográfiás elektrospray ionizáció (Liquid Chromatography Electronspray Ionization) LC-ESI-MS: folyadékkromatográfiás elektrospray tömegspektrométer (Liquid Chromatography Electronspray Ionization Mass Spectrometry) LC-MS/MS: folyadékkromatográfiával kapcsolt tandem tömegspektrometria (Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry) LDI: lézer deszorpció/ionizáció (Laser Desorption/Ionisation) LSIMS: folyadék szekunderion tömegspektrometria (Liquid Secondary Ion Mass Spectrometry) 33

34 MALDI: mátrix-segített lézer deszorpció/ionizáció (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) MALDI-TOF MS: mátrix-segített lézer deszorpció/ionizációt alkalmazó repülési idő tömegspektrometria (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry) MS: tömegspektrometria (Mass Spectrometry) PAGE: poliakrilamid gélelektroforézis (Polyacrylamide Gel Electrophoresis) PD: plazma deszorpció (Plasma Desorption) PSD: forrás után történő bomlás (Post Source Decay) SA: mustársav (Sinapic Acid) SELDI-MS: felület-segített lézer deszorpció/ionizáció tömegspektrometria (Surface- Enhanced Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry) SIMS: szekunder ion tömegspektrometria (Secondary Ion Mass Spectrometry) TOF: repülési idő analizátor (Time-of-Flight) TS: termikus porlasztás (Thermospray ionization) UPLC-MS/MS: ultrahatékonyságú folyadékkromatográfiás tandem tömegspektrometria (Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry) 34

35 12. Irodalomjegyzék Greaves J., Roboz J.: Mass Spectrometry for Novice. CRC Press, Boca Raton (2014) Gross J.H.: Mass Spectrometry: A Textbook. Springer, Heidelberg (2004) Hoffmann E., Stroobant V.: Mass spectrometry: Principles and Applications. Wiley, Chichester (2007) Lipton M.S., Pasa-Tolic L.: Mass Spectrometry of Proteins and Peptides. Humana Press, New York (2009) Berki T., Kellermayer M., Ludány A. (szerk.) és mtsai: A fehérjekutatás modern módszertana. Medicina Kiadó, Budapest, (2011) Debreczeni L., Kovács L.G. (szerk.) Gyakorlati Laboratóriumi Medicina. Literatura Medica Kiadó, Budapest, pp (2008) Vékey K., Telekes A., Vértes Á. (szerkesztők): Medical Applications of Mass Spectrometry. Elsevier, Amsterdam (2008) 35