Bioinformatika 2 10.el

Átírás

1 10.el őadás Prof. Poppe László BME Szerves Kémia és Technológia Tsz. Bioinformatika proteomika Előadás és gyakorlat

2 Genomikavs. proteomika A genomika módszereivel nem a tényleges fehérjéket vizsgáljuk, hanem azokat az expresszálódott géneket, amelyek transzlációja az adott fehérjét eredményezi. A proteomika módszereivel a ténylegesen képződött fehérjéket vizsgáljuk. Az előzőábrán látható DNS chip az expresszálódott génekről szolgáltat információkat, így tehát csak közvetett adatokhoz juthatunk a tényleges fehérje termékekről. A genomikai megközelítés előnye, hogy a gének kisérletileg jobban hozzáférhetőek és egyszerűbben kezelhetőek, mint a fehérjék. Ennek köszönhetően napjainkban a genomikai módszerek elterjedtebbek, mint a proteomikai eljárások. A kísérleti technikák fejlődésével párhuzamosan előre jelezhetőa proteomika egyre nagyobb térnyerése. Tisztában kell lennünk azonban a genomikai megközelítés hátrányaival is. Elsőaz, hogy egy gén expressziós szintje nem feltétlenül felel meg a megfelelőprotein magas sejtbéli koncentrációjának, holott ez fontosabb ha a tényleges protein expresszió mértékére és az ezzel összefüggőbetegségre vagyunk kíváncsiak. Talán még fontosabb az, hogy a fehérjék jelentős része a transzlációt követően módosul (posttranslational modifications). Ilyen módosulások a glikozilálások (összetett cukor egységek fehérje felszínhez kötődése) és foszforilálások (foszfát egységek kötödése a fehérjéhez). Ezek a transzlációt követőmódosulások az azonos primer aminosav szekvenciával rendelkezőproteinek számos eltérő változatához vezethetnek. A genomika nem képes ezen módosulások követésére, amelyek számos 2 esetben alapvetőfontosságűak 24. lehetnek.

3 Proteomikajelent ősége A fehérjék tejes szekvenciája csak részben következtethető ki a nekik megfelelő genetikai szekvenciából. Sokszor fordulnak elő a transzlációt követően módosulások: pl. alternatív lánc összekapcsolódás, N-terminális rövidülés, poszt-transzlációs módosulások (PTM). A proteomika tehát e módosulásokat előidézőkörülmények leírását is jelenti. Mindezeken túl a fehérjék funkciója és aktivitása függ a koncentrációjuktól, még általánosabban a környezetüktől. Előfordulhat, hogy fehérjék aktiválnak másik fehérjéket, vagy az aktivitáshoz nem-fehérje kofaktorok vagy egyéb anyagok / szubsztrátok kellhetnek. Fehérjék ph-függőfolyamatokban a sejt egyik részéból a másikba transzportálódhatnak, vagy a PTM folyamata a sejt állapotától függően dinamikusan változhat, stb

4 Proteomika - összetettebb,mint agenomika A fehérjék igen változó koncentrációban fordulhatnak elő: a koncentráció tartományt fog át a transzkripciós faktoroktól az albuminig. Egy adott gén egy adott szövetben akár 20 feletti protein formában expresszálódhat: pl. a humán plazmában az -1-antitripszinnek legalább különbözó 22 protein formája ismert. A fehérjék fiziko-kémiai sajátságai extrém módon különbözhetnek: molekula tömegük a néhány ezertől akár egymillió Dalton-ig terjedhet. Az oldhatóságuk, izoelektromos pontjuk (pi) és PTM hajlamuk is igen eltérőlehet. Az emberi szervezetben (a becsült mintegy gén expressziós termékeként) vélhetően előforduló fél-egy millió protein elemzése igazi kihívás mint technológiai, mind bioinformatikai szempontból. A vizsgálatok nagyfelbontású fehérjeelválasztási módszereket, a mintaelőkészítés / a kísérleti módszerek és az adatbázis kezelés nagyfokú automatizálását / parallelizációját igénylik. Igen fontosak a feljett vizualizációs technikák

5 Proteomika kölcsönhatások/ módszerek Az azonosított és jellemzett fehérjék funkcióját is meg kell határozni, ami sokszor nem egyszerű. A fehérjék igen gyakran protein komplexeket képezve kölcsönhatásban állnak egymással, vagy más fontos biomolekulákkal, mint a DNS. Aktivitásuk kapcsolódhat kisebb, molekulákkal pl. kofaktorokkal, hormonokkal történőkölcsönhatásokhoz, így tehát érthető, hogy igen változatos kísérleti technikák lehetnek szükségesek az új diagnosztikus tesztek kifejlesztéséhez. A proteom amely a genom egy adott szervezet adott szövétben egy adott időben exprimálódó proteinjeinek összességeként írható le analízise számos módszer kombinációját igényli. A módszerek lehetnek kísérleti (wet-lab experiments) és bioinformatikai (dry-lab experiments) eljárások. Figyelembe véve a proteomban előforduló proteinek kémiai és fizikai komplexitását, változatos módszerek felhasználását kell megfontolni. A következő ábra lineáris útvonala a proteom elemzéséhez szükséges nedves és száraz lépéseket tartalmazza

6 Aproteomika útvonala Minta Elválasztás Folt kiválasztása Adatbázisok Azonosítás Elválasztás utáni analízis

7 Proteomikater ületei éseszk özei Gél elektroforézis 1- és 2-dimenziós elválasztások, nagy érzékenység, nagy áteresztőképesség Profilkészítés Gél-mentes elválsztás jelölésekkel Protein / peptid szinten Többdimenziós LC Izobár / izotóp jelölés Azonosítás Tömegspektrometria (MS) Peptide mass fingerprint azonosítás LC-MS és LC-MS/MS azonosítás és kvantifikálás MALDI-TOF/TOF azonosítás és kvantifikálás Bioinformatika Differenciális proteinexpresszió azonosítása Szekvencia-analízis Biológiai funkció / relevancia elemzése Validálás Tesztek fejlesztése Immunoanalízis ELISA, western blot, immunohisztokémia MS módszerek TMT referenciaanyagok, MRM

8 Proteomika - mintaelőkészítés Elsőként a megfelelőmintát és mintaelkészítési módszert kell kiválasztani. A minta lehet a nyers biológiai folyadék, egy sejt extraktum, előkezelt minta, stb. A minta megválasztása alapvetőfontosságú, mivel ez erősen függ az elválasztásra használni kívánt módszertől. A minta komplexitásának mind a komponensek számát, mind az átfogott tartományok szélességének tekintve megfelelőnek kell lennia a kiválasztott elválasztási módszerhez

9 Proteomika A minta fehérjéit el kell választani egymástól. A proteomika az 1D de még inkább a 2D elektroforézis technikákat preferálja (1-DE) / (2-DE)

10 Proteomika foltokkiv álasztása A következőlépés az elválasztás eredményének analízise gél-vizualizációs / alakfelismerőszoftverek segítségével történik (megjelenítés, gélek összehasonlítása, statisztikai elemzések). Ezek segítenek a szignifikáns foltok kiválasztásában

11 Proteomika vizualizációsszoftver

12 Proteomika vizualizációsszoftver

13 Proteomika elválasztásut ánianal ízis A további elemzésekhez a kiválasztott proteineket elválasztás utáni elemzésnek vetik alá. Ez a specifikus fehérje-sajátságok mint az aminosav-összetétel, szekvencia információ kísérleti meghatározásához endoproteázokkal végzett hasítási lépést igényel. Ezen endoproteázokkal végzett hasítások során a proteineket tipikusan olyan enzimekkel inkubálják, melyek egy adott aminosavat felismerve a polipeptid-láncot specifikusan hasítják

14 Proteomika MSanal ízis Ez egy rövidebb peptidekből álló ún. emésztett proteineket tartalmazó elgyet eredményez. A standard eljárás tripszint alkalmaz és a képződőtt fragmenseket gyakran LC elválasztást követően Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) vagy Electrospray Ionization (ESI) MS (TOF) módszerekkel vizsgálja

15 Proteomika (Szekvencia)adatokelemz ése A tömegspektrumból meghatározott (szekvencia)adatokat a megfelelő adatbázisokkal összevetve megtalálható a kísérletileg meghatározott és a in-silico emésztett protein szekvencia-adatbázis közötti legjobb egyezés, ami felhasználható a fehérje azonosítására és karakterizálására. (Ld. korábban: mass fingerprinting )