Biomassza alapú bioalkohol előállítási technológia fejlesztése metagenomikai eljárással

Átírás

1 Biomassza alapú bioalkohol előállítási technológia fejlesztése metagenomikai eljárással Kovács Zoltán ügyvezető DEKUT Debreceni Kutatásfejlesztési Közhasznú Nonprofit Kft.

2 Problémadefiníció Első generációs bioüzemanyag előállítás: Humán élelmiszer v. állati takarmány (kukorica, burgonya, cukorrépa, cirok, búza, árpa) Probléma: drága és verseny van a nyersanyagért Második generációs bioüzemanyag előállítás: Nyersanyag: olcsó mezőgazdasági melléktermékek (kukorica szár, szalma, cirok, switchgrass, fa nyár, fűz) Nagy mennyiségben áll rendelkezésre Probléma: cellulóz, hemicellulóz, lignin bontása - enzimes előkezelés szükséges, ami jelenleg drága, rossz hatásfokú

3 A projekt áttekintése A projekt célja, a biomassza alapú bioalkohol (bioetanol, biobutanol) gyártás hatékonyságának növelése, új, hatékonyabb celluláz enzimek azonosításával. Az enzimkereséshez a metagenomika módszerét választottuk, így a mintában található összes organizmus örökítő anyaga vizsgálhatóvá vált, olyan mikroorganizmusoké is, amelyek laboratóriumi körülmények között nem vagy nehezen tanulmányozhatóak. Az alkalmazott új generációs szekvenátor (NGS) adatainak kiértékeléséhez alkalmas bioinformatikai technológiát fejlesztettünk. Létrehoztunk egy szekvencia hasonlóságon alapuló potenciálisan cellulázokat kódoló gén adatbázist. A legígéretesebbnek tűnő celluláz enzimeket kódoló szekvenciákat azonosítottuk, expressziós konstrukciókba építettük, majd élesztő törzsben termeltettük. Optimalizáltuk a termelés körülményeit így csökkenthettük a downstream folyamatok költségét, elsősorban azáltal, hogy a fehérje kinyerése egyszerűen megoldható a fermentlé koncentrálásával. Elvégeztük az előállított enzimek biokémiai jellemzését, és megvizsgáltuk hasznosíthatóságukat az iparban, metagenomikai alapú módszerünket is validálva ezzel.

4 Hipotézis A környezetünkben hatékonyabb enzimek is találhatóak, mint az iparban jelenleg alkalmazottak. Hatékony cellulázok a cellulóz lebontásával energiát nyerő mikroorganizmusokban fordulnak elő a legnagyobb valószínűséggel Ilyen élőhelyeken (kukorica szilázs, marha bendő) több faj él egymásra utalva jórészük labor körülmények között nem tartható fenn, így enzimjeik sem vizsgálhatóak. A metagenomikai megközelítés lényege, hogy egy élőhely összes fajának DNS-t vizsgáljuk. (tenyésztés nélkül) A már ismert cellulázok szekvenciáitól részben eltérő enzimeket keresünk amelyek bizonyos szempontból hatékonyabbak lehetnek.

5 A BAC könyvtárban azonosított klónokból izoláljuk a megfelelő enzimet kódoló fragmenst és jó termelőképességű élesztőtörzsben fejeztetjük ki, optimalizáljuk Marha a bendő termelést Szilázs 1. Mintavétel, teljes DNS izolálás. Tisztított DNS 2. Fragmentálás Enzim termelés élesztő törzsben: fizikai, kémiai jellemzés 7. Az érdekes eltéréseket mutató enzimet kódoló fragmenst tartalmazó klónokat megfelelő próbával visszakeressük a BAC könyvtárból 6. Meghatározzuk a konszenzus szekvenciát és az eltéréseket az ismert szekvenciához képest 5. Bioinformatika: A readeket ismert celluláz enzimek szekvenciáira illesztettük bp hosszú fragmensek 3. BAC-könyvtár: Tárolás, visszakereshetőség, reprezentatívan tartalmazza a mintában előforduló szervezetek genomjának fragmenseit az egyes baktérium klónokban. 4. Az inzerteket felszaporítjuk, rövid (35 vagy 50 bp) oligonukleotidokra tördeltük és megszekvenátuk (meghatároztuk a bázissorendjüket)

6 Kutatás I. 1. Mintavétel: 10 x 50 ml marha bendő tartalom 10 x 50 ml szilázs minta 2. DNS-t tisztítás: (M: molekulasúly marker, B2: B2 bendőtartalom totál DNS (5 ul vizualizálva 100uL mintából) 3. BAC (bacterial artificial chromosome) könyvtár készítés 4. A DNS könyvtárban kapott klónok szekvenálása (A Baygen Intézetben végezték el Applied Biosystems SOLiD 4 berendezéssel) bendő minta: 35 Millió read/35 szilázs 50 bp mate-paired /65 Millió read

7 Kutatás II. 1. Bioinformatikai eszközök fejlesztése: 1. Referencia-illesztő program 2. Vizualizáló program viewer 2. Az enzimek biokémiai jellemzése 3. Celluláz enzimtermelési technológia kidolgozása

8 Sikeres mintavétek és totál DNS tisztítás Eredmények I. BAC könyvtár készítése: klón mintánként Szekvenálás: bendő: 35 bp fragmens / 35 Millió read Szilázs: 50 bp mate-paired / 65 Millió read Bioinformatika: Illesztő program Vizualizáló program Adatelőkészítés: zajcsökkentés, kukorica és marha genomból származó readek eltávolítása Faj azonosítás: 16S rdns, és 18S rdns Referencia enzimlista nyilvános adatbázisokból Az illesztés eredményeként kapott konszenzus szekvenciák SNP és IN/DEL azonosítása

9 Potenciális enzimek: Eredmények II. 1. Molekulatömeg (Mr): 59,2 kda, Izoelektromos pont (PI): 7,46 2. Molekulatömeg (Mr): kda, Izoelektromos pont (PI): 5.55 Az enzimek kódoló DNS szekvenciáit plazmidba építettük (pklace1 és pklace2) Kluyveromyces lactis-ban történő termeltetésre. Kihozatali értékeink: Enzim 1 Enzim 2 Enzim (g)/fermentlé(l) 0,6 g/l 0,4 g/l

10 A végrehajtás során szerzett és a jövőben hasznosítható eredmények, tapasztalatok Metagenomikai munkafolyamat know-how: Lehetséges az enzimkeresés Bioinformatikai fejlesztés Biokémiai jellemzés Termeltetés optimalizálás A szekvenálási adatok kiértékeléséhez létrehozott programok: referencia illesztő: szabadon paraméterezhető, a későbbiekben más NGS adatok feldolgozásához is felhasználható program illessztési fájlokat vizualizáló program (Viewer)

11 Nyilvánosság Rimini, 14th International Biotechnology Symposium and Exhibition Biotechnology for the Sustainability of Human Society szeptember

12 Köszönöm a figyelmet! kovacs.zoltan@dekut.hu